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AllenFuminori Takahashi, Takehiro Suzuki, … Kazuo ShinozakiShenqi Wang, Zimin Zhou, … Auf Sun LauNature Communications Band 13, Artikelnummer: 5040 (2022 ) Diesen Artikel zitierenStomatale Poren ermöglichen den Gasaustausch zwischen Pflanze und Atmosphäre.Die Entwicklung der Stomata wird durch mehrere intrinsische Entwicklungs- und Umweltsignale reguliert.Hier zeigen wir, dass räumlich gemustertes Wasserstoffperoxid (H2O2) eine wesentliche Rolle bei der Stomaentwicklung spielt.H2O2 ist in Meristemoiden bemerkenswert angereichert, was durch räumliche Expressionsmuster der H2O2-fangenden Enzyme CAT2 und APX1 festgestellt wird.SPEECHLESS (SPCH), ein Hauptregulator der Stomaentwicklung, bindet direkt an die Promotoren von CAT2 und APX1, um deren Expression in Meristemoidzellen zu unterdrücken.Mutationen in CAT2 oder APX1 führen zu einem erhöhten stomatalen Index.Die ektopische Expression von CAT2, angetrieben durch den SPCH-Promotor, hemmt signifikant die stomatale Entwicklung.Darüber hinaus aktiviert H2O2 den Energiesensor SnRK1, indem es die Kernlokalisierung der katalytischen α-Untereinheit KIN10 induziert, die SPCH stabilisiert, um die stomatäre Entwicklung zu fördern.Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass das räumliche Muster von H2O2 in epidermalen Blättern entscheidend für die optimale Entwicklung der Stomata bei Arabidopsis ist.Stomata kontrollieren Gasflüsse zwischen den inneren Lufträumen der Blätter und der äußeren Atmosphäre und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der CO2-Aufnahme für die Photosynthese sowie der Wasserverdampfung durch Transpiration1,2,3.Bei Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) entstehen Stomata aus einer Untergruppe von undifferenzierten Meristemoid-Mutterzellen, die einer asymmetrischen Zellteilung unterzogen werden, um eine Meristemoid- und eine Stomatal-Lineage-Grundzelle (SLGC) als ihre kleineren bzw. größeren Tochterzellen zu erzeugen.Das Meristemoid ist der Stomatavorläufer, der eine bis drei asymmetrische Teilungen durchlaufen kann, um Schutzmutterzellen zu produzieren1,2.Die Schutzmutterzelle durchläuft eine einzelne symmetrische Teilung, um schließlich ein Paar Schutzzellen zu erzeugen, die eine mikroskopisch kleine Pore umgeben4.Die Teilung und Differenzierung von Stomata-Linienzellen werden durch eine Reihe eng verwandter und sequentiell exprimierter basischer Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktoren SPEECHLESS (SPCH), MUTE und FAMA in Arabidopsis streng kontrolliert4,5,6.SPCH wird hauptsächlich in den Meristemoidzellen exprimiert und reguliert die Initiation und Proliferation von Stomata-Vorläufern5.Mehrere endogene und umweltbedingte Signale regulieren die SPCH-Aktivität fein, um die stomatale Entwicklung als Reaktion auf sich ändernde Umgebungen zu kontrollieren7,8,9,10,11.Wasserstoffperoxid (H2O2), ein endogenes Oxidationsmittel, das in allen aeroben Zellen vorhanden ist, wurde kürzlich als Schlüsselsignalmolekül bei der Regulierung von Pflanzenstammzellen angesehen12,13.Mehrere Studien haben berichtet, dass die räumliche Verteilung von H2O2 entscheidend für die Aktivitäten von Pflanzenstammzellen ist14,15,16,17.Im apikalen Meristem des Sprosss (SAM) ist H2O2 in der peripheren Zone bemerkenswert angereichert, um die Differenzierung der Stammzellen zu fördern15.Das angesammelte H2O2 induziert die reversible Proteinphasentrennung des Transkriptionsfaktors TERMINATING FLOWER (TMF) im SAM der Tomate.Die H2O2-induzierte oxidative Modifikation aktiviert TMF, um das florale Identitätsgen ANANTHA zu binden und dessen Expression zu hemmen, wodurch das Schicksal der Stammzellen für den Übergang zur Blüte gesteuert wird17.Im apikalen Wurzelmeristem (RAM) reichert sich H2O2 hauptsächlich in den expandierenden Zellen der Elongationszone an, während O2•− hauptsächlich in den sich teilenden Zellen der Meristemzone akkumuliert.Der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor UPBEAT1 (UPB1) reguliert die Expression einer Reihe von Peroxidasen, die an der Bildung des Gradientenmusters der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Wurzelspitzen beteiligt sind14.Das Peptid ROOT MERISTEM GROWTH FACTOR1 (RGF1) spielt auch eine entscheidende Rolle für das ROS-Gradientenmuster in Wurzelspitzen.Die RGF1-Bindung an den RGF1-Rezeptor (RGFR) aktiviert den Transkriptionsfaktor RGF1 INDUCIBLE TRANSCRIPTION FACTOR1 (RITF1), um die ROS-Verteilung zu kontrollieren und die Stabilität von PLT1/2 zu verbessern, wodurch die Größe des Wurzelmeristems bestimmt wird16.Neben SAM und RAM gibt es in Pflanzen noch weitere Meristeme, um ihre eigene Entwicklung zu regulieren;Es bleibt jedoch unklar, ob H2O2 ein bestimmtes räumliches Verteilungsmuster in anderen Meristemen aufweist, um deren Aktivitäten zu steuern.Die Aufrechterhaltung der zellulären und organismischen Energiehomöostase ist für alle lebenden Organismen lebenswichtig.Eukaryoten haben ein sehr ausgeklügeltes System entwickelt, um den Stoffwechsel basierend auf der Nährstoffverfügbarkeit zu modulieren18.Eine zentrale Komponente dieses Systems in Pflanzen ist SUCROSE NON-FERMENTING-1 (SNF1)-RELATED KINASE 1 (SnRK1), die ortholog zu AMP-ACTIVATED KINASE (AMPK) und SNF1 in Säugetieren bzw. Hefe ist19,20,21 .SnRK1/AMPK/SNF1 fungieren als zelluläre Energiesensoren, um katabolische Reaktionen auszulösen und energieverbrauchende anabole Prozesse zu unterdrücken, wenn die Energieversorgung begrenzt wird22,23.SnRK1 in Arabidopsis ist ein heterotrimerer Komplex, der eine katalytische α-Untereinheit (KIN10, KIN11 und KIN12), zwei regulatorische Untereinheiten, bestehend aus drei Isoformen von KINβ (KINβ1, KINβ2 und KINβ3), und eine atypische KINβγ-Untereinheit enthält20,24.Energiearmer Stress, der durch Dunkelheit oder Hypoxie verursacht wurde, förderte die Kerntranslokation von KIN10, um die nachgelagerte Genexpression zu regulieren25.Die myristoylierten und membranassoziierten SnRK1-β-regulatorischen Untereinheiten interagieren mit KIN10 und schränken seine Kernlokalisierung ein, wodurch seine Funktionen gehemmt werden25,26.Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass KIN10 das allgegenwärtige Expressionsmuster in allen Epidermiszellen von Arabidopsis-Blättern aufweist, aber hauptsächlich im Kern von Meristemoidzellen lokalisiert ist, um SPCH zu phosphorylieren und zu stabilisieren und dann die Entwicklung der Stomata zu fördern11.Der molekulare Mechanismus der spezifischen Kernlokalisation von KIN10 in Meristemoidzellen bleibt jedoch unklar.Hier haben wir gezeigt, dass H2O2 spezifisch in Meristemoiden angereichert ist, um die Wechselwirkung zwischen KIN10 und KINβ2 zu reduzieren, wodurch die Kernlokalisierung von KIN10 gefördert und SPCH aktiviert wird, um die Stomaentwicklung zu fördern.Unsere vorherige Studie zeigte, dass KIN10 in allen Epidermiszellen von Arabidopsis-Blättern exprimiert wird, wenn Pflanzen in ½ MS-Flüssigmedium mit 1 % Saccharose unter Langtagbedingungen gezüchtet wurden, aber die subzelluläre Lokalisierung des KIN10-Proteins ein spezifisches räumliches Muster aufwies und angereichert war im Zellkern der Stomata-Linienzellen und Schließzellen sowie im Zytoplasma der Pflasterzellen in den Epidermiszellen von Arabidopsis-Keimblättern11.Um zu bestimmen, ob KIN10 ein solches räumliches subzelluläres Lokalisierungsmuster in Pflanzen aufweist, die unter anderen Umweltbedingungen gezüchtet werden, haben wir die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 in Keimblatt-Epidermiszellen von Pflanzen analysiert, die in ½ MS-Festmedium mit oder ohne 1% Saccharose unter verschiedenen Lichtintensitäten gezüchtet wurden oder unterschiedliche Photoperiodenbedingungen.Die Ergebnisse zeigten, dass die im Kern lokalisierten KIN10-Proteine ​​unter allen untersuchten Bedingungen in den Stomata-Linienzellen und Schließzellen stark angereichert waren und dass Saccharose dieses Verteilungsmuster von KIN10 verstärkte (Ergänzende Abb. 1a – d).Um festzustellen, ob dieses räumliche subzelluläre Lokalisierungsmuster von KIN10 in anderen Blättern vorhanden ist, haben wir die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 in den Rosettenblättern analysiert und ein ähnliches Verteilungsmuster wie in Keimblättern gefunden (Ergänzende Abb. 1e, f).Diese Ergebnisse legen nahe, dass das räumliche subzelluläre Lokalisierungsmuster von KIN10 in Pflanzenblättern weit verbreitet ist.Es wurde berichtet, dass metabolischer Stress, der durch Hypoxie oder eine Behandlung mit 3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-Dimethylharnstoff (DCMU) verursacht wird, eine KIN10-Kerntranslokation induziert21.ROS sind die Nebenprodukte des aeroben Stoffwechsels und spielen eine entscheidende Rolle bei Pflanzenwachstum, Entwicklung und Stressreaktionen12,13.Daher spekulierten wir, dass metabolischer Stress ROS erzeugen könnte, um die Kernlokalisierung von KIN10 zu induzieren.Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir den H2O2-Gehalt von Wildtyppflanzen in Gegenwart oder Abwesenheit von DCMU und/oder Kaliumiodid (KI), einem Quencher von H2O2, unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA ).Die Ergebnisse zeigten, dass die DCMU-Behandlung die H2O2-Spiegel signifikant erhöhte, während die gleichzeitige Behandlung mit DCMU und KI die H2O2-Akkumulation hemmte (Ergänzende Abb. 2a, b und 3a, b).Die Färbung mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) bestätigte weiter, dass die DCMU-Behandlung zu einer H2O2-Ansammlung in den Blättern führte, während die gleichzeitige KI-Behandlung den Wirkungen von DCMU stark entgegenwirkte (ergänzende Abb. 2c, d).Um die Wirkungen von DCMU und KI auf die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 zu untersuchen, analysierten wir die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 in den Blattepidermiszellen der transgenen pKIN10::KIN10-YFP-Pflanzen, die auf ½ MS-Festmedium gezüchtet wurden, das DCMU enthielt oder mit oder ohne Besprühen und/oder KI.Die Behandlung mit DCMU erhöhte das Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von KIN10-YFP in den Stomata-Linienzellen, Pflasterzellen und Schließzellen signifikant, aber solchen Wirkungen von DCMU wurde durch die gleichzeitige Behandlung mit KI entgegengewirkt (Abb. 1b – d, ergänzende Abb. 3c , d und 4a, b).Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass H2O2 eine wichtige Rolle für die DCMU-induzierte KIN10-Kernlokalisierung in Pflanzen spielt.a Diagramm der fortschreitenden Stomata-Linie in der Epidermis der frühen Blätter von Arabidopsis.M-meristemoide Zelle, Grundzelle der SLGC-Stomatalinie, PC-Pflasterzelle, GC-Schutzzelle.b–d KI verhindert DCMU-induzierte Kernlokalisierung von KIN10-YFP in M ​​und SLGC.Sämlinge von pKIN10::KIN10-YFP transgenen Pflanzen wurden mit oder ohne 50 &mgr;M DCMU und/oder 1 mM KI für 12 h behandelt.n = 113 (Mock), n = 107 (DCMU) und n = 108 (DCMU + KI) Meristemoid- oder SLGC-Zellen in 10 Keimblättern wurden von ImageJ in d analysiert.B. H2O2 induziert die Kernlokalisierung von KIN10-YFP in Pflanzen.Sämlinge von pKIN10::KIN10-YFP-transgenen Pflanzen wurden mit oder ohne 2 mM H2O2 und/oder 50 μM CHX für 2 h behandelt.n = 102 (Mock), n = 110 (H2O2), n = 103 (CHX) und n = 101 (CHX + H2O2) Meristemoid- oder SLGC-Zellen in 10 Keimblättern wurden von ImageJ in g analysiert.h–l Die Überexpression von CAT2 reduziert die nukleäre Lokalisierung von KIN10-YFP.n = 102 (Col-0), n = 104 (p35S::CAT2-Myc) Meristemoid- oder SLGC-Zellen in 10 Keimblättern wurden von ImageJ in l analysiert.Sämlinge von pKIN10::KIN10-YFP (b–g) und pKIN10::KIN10-YFP/p35S::CAT2-Myc (h–l) transgenen Pflanzen wurden auf ½ MS Festmedium mit 1 % Saccharose unter 16 h Licht/ 8 h Dunkel-Photoperiode mit 100 µMol/m2/s für 4 Tage.Zur quantitativen Analyse wurden serielle Z-Stapel-Projektionsbilder verwendet.Die weißen Pfeile innerhalb der Bilder zeigen die Bereiche, die für Zeilenscan-Messungen verwendet wurden, die die in den unteren Feldern gezeigten Plotprofile ergaben.C1, zytoplasmatische Signale von KIN10-YFP in Meristemoidzellen;N1, Kernsignale von KIN10-YFP in Meristemoidzellen;C2, zytoplasmatische Signale von KIN10-YFP in SLGC;N2, Kernsignale von KIN10-YFP in SLGC.Boxplot zeigt Maxima, erstes Quartil, Median, drittes Quartil, Minima.Unterschiedliche Buchstaben über den Balken weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Proben hin (Brown-Forsythe-ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest, p < 0,05 (d, g); Zweiweg-ANOVA-Analyse, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, p < 0,05 (l)).Für den Mehrfachvergleichstest wurden Anpassungen vorgenommen.Maßstabsbalken in konfokalen Bildern repräsentieren 10 µm.Um die Auswirkungen von H2O2 auf die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 zu untersuchen, analysierten wir die relativen Niveaus der nuklearen und zytoplasmatischen Signale von KIN10-YFP mit oder ohne H2O2-Behandlung.Die Ergebnisse zeigten, dass die H2O2-Behandlung das Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von KIN10-YFP in Meristemoiden, stomatalen Abstammungszellen, Pflasterzellen und Schließzellen signifikant erhöhte (Abb. 1e–g, ergänzende Abb. 4c, d und 7a–f). .Um festzustellen, ob die H2O2-induzierte Kernlokalisierung von KIN10 auf die Biosynthese des KIN10-Proteins zurückzuführen ist, analysierten wir die H2O2-geförderte Kernanreicherung von KIN10 in Gegenwart von Cycloheximid (CHX), einem Proteintranslationsinhibitor.Die Ergebnisse zeigten, dass CHX die H2O2-vermittelte Kernlokalisierung von KIN10 nicht beeinflusste (Abb. 1e–g und ergänzende Abb. 4c, d).Um festzustellen, ob andere ROS-Typen die Kernlokalisation von KIN10 regulieren, analysierten wir die subzelluläre Lokalisation von KIN10 in Gegenwart von Methylviologen (MV) oder N,N'-Dimethylthioharnstoff (DMTU), die spezifische Superoxidanionen (O2•− )-erzeugendes Reagenz bzw. Radikalfänger27,28.Die Ergebnisse zeigten, dass die MV- und DMTU-Behandlung keine signifikanten Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 in den Epidermiszellen von Arabidopsis-Keimblättern hatte (ergänzende Abb. 5a – d).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass H2O2 spezifisch die Kernlokalisierung von KIN10 in Pflanzen induziert.Um diese pharmakologischen Daten zu untermauern, analysierten wir die Auswirkungen von H2O2 auf die subzelluläre Lokalisierung von KIN10 in Katalase-überexprimierenden Pflanzen (p35S::CAT2-Myc), die weniger H2O2 in Pflanzen anreichern.Die Ergebnisse zeigten, dass die nuklearen Signale von KIN10-YFP in den Stomata-Linienzellen, Pavement-Zellen und Schließzellen in den p35S::CAT2-Myc-Pflanzen im Vergleich zu denen im Wildtyp-Hintergrund signifikant reduziert waren und solchen Reduktionseffekten entgegengewirkt wurde durch H2O2-Behandlung (Abb. 1h – l und ergänzende Abb. 6a, b).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass H2O2 eine wichtige Rolle bei der KIN10-Kernlokalisierung in Pflanzen spielt.In Anbetracht der wichtigen Rolle von H2O2 bei der KIN10-Kernlokalisierung in Pflanzen wird spekuliert, dass die Meristemoidzellen hohe Mengen an H2O2 enthalten könnten.Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir das H2O2-Verteilungsmuster in Cotyledon-Epidermiszellen von Wildtyppflanzen, die auf ½ MS-Festmedium mit 1 % Saccharose unter Langtagbedingungen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe H2DCFDA und BES-H2O2-Ac gezüchtet wurden.Die reduzierte nicht fluoreszierende Verbindung H2DCFDA kann oxidiert und durch intrazelluläres H2O2 in fluoreszierendes 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF) umgewandelt werden.BES-H2O2-Ac ist eine hochselektive Fluoreszenzsonde für H2O2 und weist eine höhere H2O2-Spezifität, aber ein niedrigeres Fluoreszenzsignal als H2DCFDA29 auf.Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenzsignale von H2DCFDA und BES-H2O2-Ac in den Meristemoidzellen und Schließzellen spezifisch angereichert waren, aber weniger in Pflasterzellen von Arabidopsis-Blättern auf der abaxialen Seite verteilt waren.(Abb. 2a – h und ergänzende Abb. 8a – d).HyPer ist eine genetisch codierte Sonde, in der der H2O2-sensitive Transkriptionsfaktor OxyR in ein zirkulär permutiertes gelb fluoreszierendes Protein eingebaut ist30.Es hat sich gezeigt, dass Hyper sehr empfindlich auf H2O2 und nicht auf andere ROS30 reagiert.Die HyPer exprimierenden Pflanzen wurden verwendet, um die Echtzeitproduktion von H2O2 in Pflanzen zu analysieren.In den transgenen pHyPer-Pflanzen wird der H2O2-Gehalt gemessen, indem das Verhältnis der Fluoreszenzsignale bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm relativ zu dem bei 405 nm bestimmt wird31.In den abaxialen Epidermiszellen von Wildtypblättern war das Verhältnis der Fluoreszenzsignale in den Meristemoidzellen und Schließzellen höher, in den Pflasterzellen jedoch niedriger (Abb. 2i-l und ergänzende Abb. 8e, f).Die DAB-Färbung wurde auch verwendet, um das H2O2-Verteilungsmuster in den Blättern zu analysieren, und es wurde festgestellt, dass H2O2 in den abaxialen Meristemoidzellen und Schließzellen häufiger vorkam als in den Pflasterzellen (Abb. 2m).Um weiter zu überprüfen, ob H2O2 in Meristemoiden angereichert ist, untersuchten wir die Co-Lokalisierung der Fluoreszenzsignale von H2DCFDA und pSPCH::SPCH-RFP.Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenzsignale von H2DCFDA und SPCH-RFP gleichzeitig in den Meristemoidzellen vorhanden waren (Abb. 2n, o).Diese Ergebnisse zeigen, dass H2O2 in den abaxialen Meristemoiden und Schließzellen in den Epidermiszellen von Arabidopsis-Blättern stark angereichert ist.H2O2-Messung in Epidermiszellen von Wildtyp-Keimblättern mit H2DCFDA (a–d) und BES-H2O2-Ac (e–h).Vergrößerungen des Meristemoids und SLGC sind in b und f gezeigt.Die weißen Pfeile innerhalb der Bilder zeigen die Bereiche, die für Zeilenscanmessungen verwendet wurden, die die in c und g gezeigten Plotprofile ergaben.Die Pfeilmarkierung mit A1 und A2 repräsentiert die Fluoreszenzsignale in Meristemoidzellen, und die Pfeilmarkierung mit B1 und B2 repräsentiert die Fluoreszenzsignale in SLGC.i–l, Quantifizierung von pHyPer-Fluoreszenzsignalen in Cotyledon-Epidermiszellen.Ratio Imaging von Epidermiszellen von Arabidopsis, die HyPer exprimieren (k).Die Tafeln i, j, k stellen den gleichen Bereich dar, der bei 488 und 405 nm angeregt wurde, bzw. das entsprechende Verhältnisbild.Die Emission wurde bei 530 nm mit einem Bandpass von 30 nm gesammelt.Beachten Sie, dass die rote Farbe eine höhere ROS-Konzentration und die blaue Farbe eine niedrigere Konzentration anzeigt.m, DAB-Färbung in den Epidermiszellen der Blätter.Der Pfeil zeigt die Meristemoidzelle an.n, o, Co-Lokalisierung von H2DCFDA- und RFP-Signalen von pSPCH::SPCH-RFP in Kotyledonen-Epidermiszellen.Sämlinge von transgenen Col-0-, pHyPer- oder pSPCH::SPCH-RFP-Pflanzen wurden auf ½ MS-Festmedium mit 1 % Saccharose unter einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit mit 100 µMol/m2/s für 4 Tage (am ) oder 3 Tage (n, o) und anschließend mit H2DCFDA, BES-H2O2-Ac oder DAB gefärbt.Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung eines LSM700-Mikroskops von Zeiss aufgenommen.n = 104, n = 108 und n = 103 Meristemoid- oder SLGC-Zellen von 10 Kotyledonen wurden in d, h bzw. l untersucht.Die Fluoreszenzsignale von H2DCFDA, BES-H2O2-Ac oder RFP wurden mit der ImageJ-Software entlang einer auf den konfokalen Bildern gezeichneten Linie bestimmt.Maßstabsbalken in konfokalen Bildern repräsentieren 20 μm.Der Boxplot zeigt Maxima, erstes Quartil, Median, drittes Quartil, Minima.Sternchen zwischen den Balken zeigten statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Stichproben an (zweiseitiger Student-t-Test, ****p < 0,0001, ***p < 0,001).Um die Anreicherung von H2O2 in Meristemoiden und Schließzellen zu verifizieren, analysierten wir auch das H2O2-Verteilungsmuster in cat2-cat3-, upb1-, p35S::CAT2-Myc- und p35S::UPB1-Pflanzen14,32.CAT2 und CAT3 sind Schlüsselenzyme der Katalase, die H2O2 in Pflanzen fangen33,34.Es wurde berichtet, dass UPB1 eine Reihe von Peroxidasen unterdrückt, um die Meristemaktivität in den Pflanzen zu regulieren14,15.Die H2DCFDA-Fluoreszenzsignale waren in den cat2-cat3- und p35S::UPB1-Pflanzen stärker als in den Wildtyp-Pflanzen, während das Verteilungsmuster von H2O2 dem in Wildtyp-Pflanzen ähnlich war.Die H2DCFDA-Fluoreszenzsignale waren in den upb1- und p35S::CAT2-Myc-Pflanzen schwächer als die in Wildtyppflanzen, und H2DCFDA-Fluoreszenzsignale wurden nur in den abaxialen Schließzellen beobachtet, aber sehr schwach in Meristemoid- und Pflasterzellen (ergänzende Abb. 9a–d).Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Katalase und UPB1 wichtige Rollen im H2O2-Verteilungsmuster in Epidermiszellen von Blättern spielen.Um zu bestimmen, ob das räumliche Muster von H2O2 in den Epidermiszellen weit verbreitet ist, analysierten wir das H2O2-Verteilungsmuster in den Keimblatt-Epidermiszellen von Pflanzen, die auf ½ MS-Festmedium mit oder ohne 1 % Saccharose unter verschiedenen Lichtintensitäten oder verschiedenen Photoperiodenbedingungen gezüchtet wurden.Die Ergebnisse zeigten, dass sich H2O2 unter allen untersuchten Bedingungen spezifisch in den Meristemoidzellen ansammelte (Ergänzende Abb. 10a – d).Wir haben auch das H2O2-Verteilungsmuster in den Rosettenblättern analysiert und festgestellt, dass H2O2 in den Meristemoidzellen stark angereichert war (ergänzende Abb. 10e, f und 11a–d).Diese Ergebnisse legen nahe, dass das räumliche Muster von H2O2 in der Epidermiszelle von Arabidopsis-Blättern weit verbreitet ist.Um festzustellen, ob andere Arten von ROS das spezifische Verteilungsmuster in den Epidermiszellen von Blättern aufweisen, analysierten wir das O2•−-Verteilungsmuster mit dem fluoreszierenden Farbstoff Dihydroethidium (DHE), der O2•− spezifisch nachweist.Die Ergebnisse zeigten, dass O2•− gleichmäßig in den abaxialen Epidermiszellen der Blätter verteilt war und kein spezifisches Verteilungsmuster aufwies (Ergänzende Abb. 12a – f).Um den Mechanismus aufzuklären, der der H2O2-spezifischen Akkumulation in Meristemoidzellen zugrunde liegt, analysierten wir die Expressionsmuster von ROS-verwandten Genen in den veröffentlichten zelltypspezifischen Transkriptomdaten von Arabidopsis-Blättern.Die Expressionsniveaus mehrerer ROS-Abfanggene wie CAT2 und ASCORBATE PEROXIDASE 1 (APX1) waren in den Meristemoidzellen niedriger als in anderen Zelltypen35.Um die Ergebnisse der bioinformatischen Analyse zu testen, wurden die transgenen pCAT2::GFP- und pAPX1::GFP-Pflanzen generiert, um die Expressionsmuster von CAT2 und APX1 in den Epidermiszellen von Blättern zu untersuchen.Die Fluoreszenzsignale von pCAT2::GFP und pAPX1::GFP wurden in den Pflasterzellen deutlich beobachtet, waren jedoch in den kleineren Zellen und Schutzzellen schwer zu erkennen (Abb. 3a – d und ergänzende Abb. 13a – c).Im Allgemeinen zeigten die Expressionsmuster von CAT2 und APX1 eine positive Beziehung zwischen der Intensität von GFP und der Größe der Epidermiszellen (ergänzende Abb. 14a – d).Die Kolokalisierungsanalyse mit pCAT2::GFP und pSPCH::SPCH-RFP ergab, dass pCAT2::GFP sehr schwache Signale in den mit pSPCH::SPCH-RFP markierten Meristemoidzellen zeigte (Abb. 3e–g).Diese Ergebnisse zeigen, dass CAT2 und APX1 niedrige Expressionsniveaus in Meristemoiden haben.a–d Das Expressionsmuster von CAT2 in den Keimblatt-Epidermiszellen.Vergrößerungen der epidermalen Zellen sind in b gezeigt.Die pCAT2::GFP-Fluoreszenzsignale waren grün, PI-markierte Zellumrisse waren rot.Zusammengeführte Bilder zeigten die höheren CAT2-Expressionsniveaus in den Pflasterzellen und die niedrigeren Niveaus in den kleineren Zellen, in denen die Zellteilung stattfindet.n = 110 (Pavement), n = 102 (SLGC) und n = 102 (meristemoide) Zellen von 10 Kotyledonen wurden in d untersucht.e–g Co-Lokalisierung von pCAT2::GFP und pSPCH::SPCH-RFP in Keimblatt-Epidermiszellen.n = 30 (Pflaster), n = 30 (SLGC) und n = 30 (meristemoide) Zellen wurden in g untersucht.h Quantitative ChIP-PCR zeigte, dass SPCH an den CAT2-Promotor bindet.Sämlinge von p35S::YFP und p35S::SPCH-YFP wurden verwendet, um ChIP-Assays durchzuführen.Die Niveaus der SPCH-Bindung wurden als das Verhältnis zwischen p35S::SPCH-YFP und p35S::YFP berechnet und dann auf das des Kontrollgens PP2A normalisiert.Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (SD) (n = 3 biologisch unabhängige Proben).i SPCH bindet in vitro direkt an den Promotor von CAT2.MBP oder MBP-SPCH wurden mit biotinylierten DNA-Fragmenten von den PP2A- und CAT2-Promotoren, die auf Streptavidin-Kügelchen immobilisiert waren, inkubiert.Die DNA-gebundenen Proteine ​​wurden unter Verwendung von Anti-MBP-Antikörper immungeblottet.j RT-qPCR-Analyse der Expression von CAT2 und BASL in Wildtyp-, spch-4-Mutanten- und p35S::SPCH-Myc-transgenen Pflanzen.Das PP2A-Gen wurde als interne Kontrolle verwendet.Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (SD) (n = 3 biologisch unabhängige Proben).Sämlinge von pCAT2::GFP (a–d), pCAT2::GFP/pSPCH::SPCH-RFP (e–g), Col-0, spch-4 und p35S::SPCH-Myc transgenen Pflanzen (j) wurden gezüchtet auf ½ MS Festmedium mit 1 % Saccharose unter 16 h Licht/8 h Dunkelheit Photoperiode mit 100 µMol/m2/s für 4 Tage (a–d) oder 3 Tage (e–g) oder 6 Tage (j). Die Fluoreszenz Signale von GFP wurden entlang einer auf den konfokalen Bildern gezeichneten Linie unter Verwendung der ImageJ-Software bestimmt.Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung eines LSM700-Mikroskops von Zeiss aufgenommen.Der Boxplot zeigt Maxima, erstes Quartil, Median, drittes Quartil, Minima.Unterschiedliche Buchstaben über den Balken zeigten statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Proben an (Brown-Forsythe-ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest, p < 0,05 (d, g); Anpassungen wurden für Mehrfachvergleichstest vorgenommen; Zweiseitiger Student-t-Test , *p < 0,05 (h); Einweg-ANOVA-Analyse, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, p < 0,05 (j). Für den Mehrfachvergleichstest wurden Anpassungen vorgenommen.).Maßstabsbalken in konfokalen Bildern repräsentieren 20 μm.Die veröffentlichten ChIP-Seq-Daten zeigten, dass SPCH an die Promotoren von CAT2 und APX136 bindet.Um dieses Ergebnis zu verifizieren, führten wir quantitative Chromatin-Immunpräzipitations-PCR (ChIP-qPCR) und DNA-Protein-Pulldown-Assays durch.Die Ergebnisse bestätigten, dass SPCH direkt an die Promotoren von CAT2 und APX1 bindet (Abb. 3h, i und ergänzende Abb. 13d, e).Die quantitative RT-PCR-Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus von CAT2 und APX1 in der spch-4-Mutante erhöht, in p35S::SPCH-Myc-transgenen Pflanzen jedoch verringert waren (Fig. 3j und ergänzende Fig. 13f).Diese Ergebnisse zeigen, dass SPCH direkt an die Promotoren der ROS-Scavenging-Gene CAT2 und APX1 bindet, um deren Expression zu unterdrücken.Um die biologische Funktion von angereichertem H2O2 in Meristemoiden zu untersuchen, untersuchten wir die Stomata-Phänotypen von Wildtyp-Pflanzen, cat2-, cat3-, cat2-cat3-, cat1-cat2-cat3-Mutanten und p35S::CAT2-Myc-Pflanzen.Die Menge an Meristemoidzellen und GMC in der abaxialen Epidermis 5 Tage nach der Keimung (DAG) war bei cat2-, cat3-, cat2-cat3- und cat1-cat2-cat3-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp signifikant erhöht, bei p35S::CAT2 jedoch verringert -Myc-transgene Pflanzen (Abb. 4a, b).Als Ergebnis zeigten die cat2- und cat3-Einzelmutanten bei 8 DAG einen leicht erhöhten Stomata-Index, der sich auf die Anzahl der Stomata relativ zur Gesamtzahl der Epidermiszellen bezieht, und die cat2-cat3-Doppelmutanten und cat1-cat2-cat3-Dreifachmutanten zeigten ein signifikant erhöhter stomataler Index (ergänzende Abb. 15a).Die Überexpression von CAT2 reduzierte den stomatalen Index dramatisch, und die H2O2-Behandlung unterdrückte teilweise den verringerten stomatalen Index von Pflanzen mit CAT2-Überexpression (ergänzende Abb. 15a, b).Um die Rolle der räumlichen H2O2-Verteilung bei der stomatalen Entwicklung zu untersuchen, manipulierten wir die CAT2-Aktivität in den Zellen der stomatalen Abstammungslinie, indem wir CAT2 unter dem SPCH-Promotor exprimierten.Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von CAT2 in Stomata-Linienzellen die Stomata-Initiation signifikant hemmte und den Stoma-Index reduzierte und die H2O2-Behandlung auch teilweise den verringerten Stoma-Index von pSPCH::CAT2-RFP-transgenen Pflanzen unterdrückte (Abb. 4a, b und ergänzende Abb 15a, b).In Übereinstimmung damit zeigten die apx1-Mutante und die transgenen p35S::UPB1-Pflanzen den signifikant erhöhten Stomata-Index, während die upb1-Mutante den verringerten Stoma-Index aufwies (ergänzende Fig. 15c).Diese Ergebnisse zeigen, dass H2O2 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Stomata spielt.a, b Quantifizierung epidermaler Zelltypen von Col-0 und angegebenen Pflanzen, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzellen.GMC, Schutzmutterzelle;M, Meristemoid.n = 13, 14, 14, 14, 14, 14, 15, 15, 12 unabhängige Keimblätter wurden in b untersucht.Sämlinge von Wildtyp-Col-0 und angezeigte Pflanzen wurden auf ½ MS-Festmedium, das 1 % Saccharose enthielt, unter einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit mit 100 &mgr;Mol/m 2 /s für 5 Tage gezüchtet.c, Quantifizierung der Auswirkungen von H2O2 auf den stomatalen Index.n = 12, 15, 14, 12 (Col-0), n = 12 (kin10) unabhängige Pflanzen wurden in c.Sämlinge von Wildtyp-Col-0 und kin10-Mutanten wurden auf ½ MS-Festmedium mit 1 % Saccharose und unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 unter einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit mit 100 µMol/m2/s für 8 Tage gezüchtet.d–g CAT-Mutationen veränderten das Zellschicksal in Arabidopsis-Epidermis.n = 14, 15, 16, 15 unabhängige Keimblätter wurden in e.n = 13, 16, 13, 16 unabhängige Keimblätter wurden in g untersucht.Sämlinge von pSPCH::nucGFP, pSPCH::nucGFP/cat2 cat3, pSPCH::SPCH-GFP und pSPCH::SPCH-GFP/cat2 cat3 wurden auf ½ MS Festmedium gezüchtet, das 1 % Saccharose mit oder ohne 1 mM KI unter enthielt 16 h hell/8 h dunkel Photoperiode mit 100 μMol/m2/s für 3 Tage.Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) an.Unterschiedliche Buchstaben über den Balken zeigten statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Proben an (Einweg-ANOVA-Analyse (b), Zweiweg-ANOVA-Analyse (c) gefolgt von unkorrigiertem Fisher-LSD-Mehrfachvergleichstest, p < 0,05; für Mehrfachvergleiche wurden keine Anpassungen vorgenommen Test, Brown-Forsythe-ANOVA-Analyse, gefolgt von Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest, p < 0,05 (e, g). Für den Mehrfachvergleichstest wurden Anpassungen vorgenommen).Maßstabsbalken in konfokalen Bildern repräsentieren 20 µm.Um die Auswirkungen von H2O2 auf die stomatäre Entwicklung weiter zu bestimmen, analysierten wir die stomatalen Phänotypen von Wildtyp- und kin10-Mutanten, die auf ½ MS-Festmedium mit verschiedenen H2O2-Konzentrationen gezüchtet wurden.Die Ergebnisse zeigten, dass H2O2 den stomatalen Index bei niedrigen Konzentrationen erhöhte, diese Effekte jedoch in Gegenwart hoher H2O2-Konzentrationen abnahmen (Abb. 4c).Die kin10-Mutante zeigte einen niedrigen Stomata-Index, und die H2O2-Behandlung hatte keine signifikanten Auswirkungen auf die Stoma-Entwicklung der kin10-Mutante (Abb. 4c).In Übereinstimmung damit konnte H2O2 den Stomata-Index von pSPCH::SPCHS4A-RFP/spch-4-transgenen Pflanzen nicht erhöhen, in denen SPCHS4A nicht durch KIN10 phosphoryliert werden konnte.Die H2O2-Behandlung erhöhte die SPCH-Proteinspiegel, hatte jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf SPCHS4A (ergänzende Abb. 16a-c).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KIN10 zur H2O2-induzierten Stomaentwicklung beiträgt.Um die Auswirkungen des CAT-vermittelten H2O2-Abfangens auf den Zellschicksalwechsel der Stomata-Linie zu bestimmen, verglichen wir die Fluoreszenzsignale der zelltypspezifischen Markerlinien pSPCH::nucGFP und pSPCH::SPCH-GFP im Wildtyp und in der cat2-cat3-Mutante Hintergrund.Die Markerlinie pSPCH::nucGFP wird hauptsächlich in Zellen der stomatalen Linie exprimiert, und die Markerlinie pSPCH::SPCH-GFP wird hauptsächlich in Meristemoiden und MMCs exprimiert.Wir beobachteten, dass die Mutation von CAT2 und CAT3 die Anzahl der durch pSPCH::nucGFP und pSPCH::SPCH-GFP markierten Zellen im Vergleich zu denen im Wildtyp-Hintergrund deutlich erhöhte, während die KI-Behandlung diese Zunahme wesentlich unterdrückte (Abb. 4d-g ).Diese Ergebnisse zeigen, dass H2O2 die Häufigkeit der Stomata-produzierenden Teilung in Arabidopsis-Blättern erhöht.Um weiter zu bestimmen, ob andere Arten von ROS die stomatäre Entwicklung regulieren, analysierten wir den stomatalen Phänotyp von Pflanzen, die mit DMTU, dem Radikalfänger, behandelt wurden.Die DMTU-Behandlung veränderte die Expressionsmuster von pSPCH::nucGFP und pSPCH::SPCH-GFP nicht und hatte keine signifikanten Auswirkungen auf den Stomata-Index (ergänzende Fig. 17a-e).Darüber hinaus zeigte die ndufs4-Mutante, bei der durch Beeinflussung der NADH-Dehydrogenase-Untereinheiten37,38 weniger O2•− in Pflanzen akkumuliert wird, einen ähnlichen stomatalen Index wie der breite Typ (ergänzende Abb. 17f).JährlichJährlichNat.Nat.Nat.Nat.biol.Nat.Nat.biol.biol.Nat.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt