BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 289 (2022) Diesen Artikel zitierenRTS,S ist der erste Malariaimpfstoff, der zur Anwendung bei gefährdeten Kleinkindern empfohlen wird.Die Wirksamkeit des Impfstoffs ist jedoch bescheiden und von kurzer Dauer.Antikörper spielen die Hauptrolle bei der impfstoffinduzierten Immunität, aber das Wissen über die Induktion, den Abbau und die Determinanten der Antikörperfunktion ist begrenzt, insbesondere bei Kindern.Antikörper, die die opsonische Phagozytose und andere Zellfunktionen fördern, scheinen wichtige Beiträge zur RTS,S-Immunität zu leisten.Wir untersuchten eine Phase-IIb-Studie mit RTS,S/AS02, die bei kleinen Kindern in Malaria-endemischen Regionen Mosambiks durchgeführt wurde.Wir untersuchten die Induktion von Antikörpern gegen das Circumsporozoitenprotein (CSP, Vakzinantigen), die mit Fcγ-Rezeptoren (FcRγs) interagieren und die Phagozytose (Neutrophile, Monozyten, THP-1-Zellen), den antikörperabhängigen respiratorischen Ausbruch (ADRB) durch Neutrophile, und Aktivität natürlicher Killerzellen (NK) sowie die zeitliche Kinetik der Reaktionen über 5 Jahre Nachbeobachtung (ClinicalTrials.gov-Registrierungsnummer NCT00197041).Die RTS,S-Impfung induzierte CSP-spezifisches IgG mit FcγRIIa- und FcγRIII-Bindungsaktivität und förderte die Phagozytose durch Neutrophile, THP-1-Monozyten und primäre menschliche Monozyten, die ADRB-Aktivität der Neutrophilen und die Aktivierung von NK-Zellen.Die Antworten waren bei Kindern sehr heterogen, und das Ausmaß der Neutrophilen-Phagozytose durch Antikörper war relativ bescheiden, was möglicherweise auf eine bescheidene Wirksamkeit des Impfstoffs zurückzuführen ist.Die Induktion funktioneller Antikörper war bei Kindern mit höherer Malaria-Exposition geringer.Die Größe der funktionellen Antikörper und die funktionelle Aktivität von Antikörpern gingen innerhalb eines Jahres nach der Impfung weitgehend zurück, und die Abnahme war in den ersten 6 Monaten am höchsten, was mit dem Rückgang der Impfstoffwirksamkeit über diesen Zeitraum übereinstimmt.Die Zerfallsraten variierten für verschiedene Antikörperparameter und der Zerfall war langsamer für die Phagozytose von Neutrophilen.Biostatistische Modellierung legte nahe, dass IgG1 und IgG3 zur Förderung der FcγR-Bindung und Phagozytose beitragen, und IgG, das auf die NANP-Repeat- und C-terminalen Regionen CSP abzielt, waren ähnlich wichtig für funktionelle Aktivitäten.Die Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse zum Verständnis der bescheidenen und zeitlich begrenzten Wirksamkeit von RTS,S bei Kindern und der Induktion funktioneller Aktivitäten von Antikörpern.Die Verbesserung der Induktion und Aufrechterhaltung von Antikörpern, die die Phagozytose und Zellfunktionen fördern, und die Bekämpfung der negativen Auswirkungen einer Malaria-Exposition auf die Impfreaktionen sind potenzielle Strategien zur Verbesserung der Wirksamkeit und Langlebigkeit von RTS,S.Die Entwicklung eines hochgradig schützenden Malaria-Impfstoffs hat weltweit Priorität, da es jährlich >240 Millionen klinische Fälle von Malaria und >600.000 Todesfälle gibt, die überwiegend bei kleinen Kindern und in Endemiegebieten in Subsahara-Afrika auftreten [1].Die meisten Malariafälle und Todesfälle werden einer Infektion mit Plasmodium falciparum zugeschrieben.Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) und Finanzierungspartner haben sich zum Ziel gesetzt, bis 2030 einen Impfstoff mit einer Wirksamkeit von ≥75 % (über 2 Jahre) zu entwickeln, aber dies hat sich als schwierig zu erreichen erwiesen.Derzeit ist RTS,S der einzige Malaria-Impfstoff, der klinische Studien der Phase III bei afrikanischen Kindern abgeschlossen hat, und im Oktober 2021 empfahl die WHO die weit verbreitete Anwendung von RTS,S bei Kindern in Subsahara-Afrika und anderen Regionen mit mäßigem bis hohem P. falciparum-Malariaübertragung [2, 3].RTS,S zeigte jedoch nur eine bescheidene Wirksamkeit bei relativ kurzer Lebensdauer.Bei kleinen Kindern im Alter von 5–17 Monaten betrug die Wirksamkeit des RTS,S-Impfstoffs gegen klinische Malaria ~50 % über 18 Monate Nachbeobachtung [4, 5].Die Wirksamkeit ließ schnell nach, so dass nach 18 Monaten nur noch eine geringe oder keine signifikante Wirksamkeit bestand [6].Wenn eine Auffrischimpfung nach 18 Monaten gegeben wurde, betrug die Wirksamkeit des Impfstoffs über 4 Jahre 36 % [7,8,9].Bemerkenswerterweise haben andere in klinischen Studien getestete Impfstoffkandidaten entweder keinen signifikanten Schutz in Zielpopulationen von Malaria-exponierten Personen gezeigt oder noch keine höhere Wirksamkeit oder längere Haltbarkeit als RTS,S bei kleinen Kindern gezeigt, die in mehreren Studien reproduzierbar ist [10, 11].Detaillierte Kenntnisse der Immunmechanismen und der Kinetik der Impfreaktionen sind erforderlich, um die beiden Haupteinschränkungen von RTS,S und anderen Impfstoffen in klinischen Studien anzugehen: mäßige Wirksamkeit und kurze Schutzdauer.Das Verständnis von Faktoren, die die Induktion von Immunantworten beeinflussen, und die Bestimmung der Kinetik von Antikörperinduktion und -zerfall könnte die Verfeinerung von RTS,S oder die Entwicklung neuer Impfstoffe mit größerer Wirksamkeit und Haltbarkeit beeinflussen [10, 12].Der RTS,S-Impfstoff basiert auf dem Circumsporozoitenprotein (CSP), einem wichtigen oberflächenexprimierten Antigen im Sporozoitenstadium von P. falciparum [13].Das Impfstoffkonstrukt besteht aus der zentralen Repeat-Region (NANP-Repeats) und der C-terminalen (CT) Region von CSP, fusioniert mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen und exprimiert als virusähnliches Partikel [14].Antikörper gegen das CSP-Impfstoffantigen sind der Hauptmediator des durch den RTS,S-Impfstoff induzierten Schutzes, obwohl auch CD4+- und CD8+-T-Zellen zur Schutzreaktion beitragen können [10].Die NANP-Repeat-[14] und CT-Regionen [15] sind beide Ziele von RTS,S-Impfstoff-induzierten Antikörpern bei Kindern [14, 16, 17], und hohe Konzentrationen von Immunglobulin G (IgG) mit diesen Domänen wurden weitgehend in Verbindung gebracht mit Schutz vor klinischer Malaria in RTS,S-Impfstoffstudien [13].Die Wirkungsmechanismen dieser Antikörper sind jedoch nicht vollständig verstanden, insbesondere bei Kindern.Darüber hinaus gibt es nur sehr begrenzte Daten zur Langlebigkeit funktioneller Antikörper nach der Impfung.Dieser Mangel an Wissen behindert Fortschritte bei der Verbesserung von RTS,S und schränkt die Entwicklung wirksamerer Impfstoffe der zweiten Generation ein.Ein immunologischer Mechanismus, der bei der Immunität gegen Krankheitserreger zunehmend erkannt wird, ist die Fähigkeit von IgG, mit Fcγ-Rezeptoren (FcγR) zu interagieren, die auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, was zu opsonischer Phagozytose und anderen Effektormechanismen führt [18,19,20,21,22]. .Wir haben kürzlich festgestellt, dass Neutrophile der Hauptzelltyp sind, der die opsonische Phagozytose von P. falciparum-Sporozoiten im Blut vermittelt, während Monozyten eine untergeordnete Rolle spielen [23].Opsonische Phagozytose von Sporozoiten durch die THP-1-Monozytenzelllinie wurde ebenfalls nachgewiesen [19, 23].Neutrophile exprimieren FcγRIIa, IIIa und IIIb auf ihrer Oberfläche, können aber die FcγRI-Expression in bestimmten Entzündungssituationen hochregulieren [24].Monozyten im Ruhestadium exprimieren überwiegend FcγRI und FcγRIIa, wobei eine kleine Untergruppe FcγRIIIa exprimiert [25].IgG-Wechselwirkungen mit FcγRIIa und FcγRIII sind für eine maximale phagozytische Aktivität von Neutrophilen bei geringem Bedarf an FcγRI erforderlich.IgG1 und IgG3 sind die potentesten IgG-Subklassen für Wechselwirkungen mit FcγRs, während bei IgG2 eine geringere funktionelle Aktivität auftritt und bei IgG4 wenig oder keine.RTS,S-induzierte IgG1- und IgG3-Antworten auf die NANP-Repeat- und CT-Regionen waren mit Schutz bei Kindern assoziiert [26], was das Potenzial für FcγR-vermittelte Effektormechanismen unterstützt.In Studien zur RTS,S-Impfung bei Malaria-naiven Erwachsenen, die dann mit einer kontrollierten experimentellen Infektion (unter Verwendung des homologen P. falciparum-Stammes) provoziert wurden, waren diejenigen mit einer stärkeren Antikörper-vermittelten Phagozytose durch Neutrophile und einer FcγRIIa- und FcγRIII-Bindung durch IgG assoziiert Schutz vor Infektionen [18, 27].Die Induktion dieser Reaktionen durch RTS,S bei kleinen Kindern in Malaria-endemischen Umgebungen ist derzeit nicht bekannt.Hier untersuchten wir die Induktion und Langlebigkeit von IgG, das mit FcγRs interagieren und die Phagozytose fördern kann, in einer Phase-IIb-Studie mit RTS,S/AS02 bei mosambikanischen Kindern, die in den Distrikten Manhiça und Ilha Josina leben.Die Teilnehmer erhielten das primäre 3-Dosen-Regime ohne nachfolgende Auffrischungsdosen.Die beiden Kohorten stellen kleine Kinder dar, die unterschiedlichen Intensitäten der Malariaübertragung ausgesetzt sind.Unser Ziel war es, die Fähigkeit von RTS,S-Impfstoff-induziertem IgG bei Kindern zu quantifizieren, Wechselwirkungen mit den aktivierenden Rezeptoren FcγRIIa und FcγRIII zu vermitteln und die Phagozytose zu fördern, und die Regionen von CSP zu identifizieren, auf die die funktionellen Antikörper abzielen.Darüber hinaus untersuchten wir, wie Alter und Malaria-Exposition die Induktion funktioneller Antikörper beeinflussten.Wir haben biostatistische Modelle angewendet, um die Zerfallsrate funktioneller Antikörper über einen Zeitraum von 5 Jahren zu bestimmen und die Beiträge verschiedener IgG-Subklassen und Antikörper zu verschiedenen CSP-Regionen zur funktionellen Antikörperaktivität abzuschätzen.Die Untersuchung des funktionellen Ansprechens in dieser Phase-IIb-Studie hatte im Vergleich zur Phase-III-Studie den Vorteil einer größeren Probenentnahme und einer längeren Nachbeobachtung, und es wurde keine Auffrischimpfung verabreicht.In dieser Studie wurden Serumproben analysiert, die aus einer zuvor veröffentlichten klinischen Phase-IIb-Studie RTS,S/AS02A (ClinicalTrials.gov-Registrierungsnummer NCT00197041) entnommen wurden.Diese klinische Studie wurde im April 2003 und Mai 2004 an zwei Studienstandorten in Mosambik durchgeführt [28], wobei der Studienstandort Manhiça eine geringe bis mäßige Malariaübertragung und der Studienstandort Ilha Josina eine hohe Malariaübertragung aufwies.Kurz gesagt, Kinder im Alter von 1–4 Jahren wurden randomisiert und erhielten 3 Dosen RTS,S/AS02 (in den Monaten 0, 1 und 2) oder einen Nicht-Malaria-Vergleichsimpfstoff (Kinder < 24 Monate erhielten den Pneumokokken-Konjugatimpfstoff und eine Dosis). des Haemophilus-influenzae-Typ-B-Impfstoffs erhielten Kinder > 24 Monate den Hepatitis-B-Impfstoff).Wir testeten Serumproben von einer Zufallsauswahl von Kindern aus den Studienzentren Manhiça (RTS, S, n = 50; Vergleichsgruppe, n = 25) und Ilha Josina (RTS, S, n = 49; Vergleichsgruppe, n = 24), die bei entnommen wurden Baseline (M0) und nach der Impfung (M3).Allerdings verblieb zum Zeitpunkt M3 nur noch ausreichend Probenvolumen für 15 Kinder zum Testen von ADRB und 22 Kinder zum Testen auf Phagozytose mit primären Monozyten.Die Probengrößen für alle Assays und Analysen sind in den Abbildungslegenden und der zusätzlichen Datei 1 angegeben. Zusätzliche Proben wurden zu späteren Zeitpunkten (M8.5, M21, M33, M45 und M63) von 30 Kindern am Studienstandort Manhiça entnommen und verwendet Antworten über die Zeit von M0 bis M63 zu quantifizieren.Malaria-Inzidenz während der Nachsorge wurde zuvor berichtet [7, 28].In den ersten 6 Monaten nach der 3. Impfdosis hatten 38 % der Kinder ein dokumentiertes Fieberereignis mit P. falciparum-Parasitämie und 18 % zwischen den Zeitpunkten M8,5 und M21 [7].Die Ethikgenehmigung für diese Studie (ClinicalTrials.gov-Registrierungsnummer NCT00197041) wurde vom mosambikanischen National Health and Bioethics Committee eingeholt;Hospital Clinic of Barcelona Ethikkommission;PATH Research Ethics Committee;Alfred Health Human Research and Ethics Committee (Protokollnummer 174/18).Die Eltern/Erziehungsberechtigten der Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Antigenen wurden zuvor beschrieben [17, 29].Kurz gesagt wurden CSP in Escherichia coli basierend auf dem 3D7-Allel P. falciparum exprimiert, wobei die Signalpeptid- und Glycosylphosphatidylinositol-Sequenzen ausgeschlossen wurden [29, 30] (hergestellt von Gennova Biopharmaceuticals, Indien; bereitgestellt von PATH Malaria Vaccine Initiative, USA).Die C-terminale Region von CSP basierte auf dem 3D7-Allel P. falciparum CSP und wurde in HEK293-Zellen exprimiert [17].Ein synthetisches Peptid von NANP ×15 wurde von Life Tein (USA) geliefert, um die zentrale Wiederholungsregion von CSP darzustellen [31].Der FcγR-Bindungsassay wurde unter Verwendung einer zuvor veröffentlichten Methode durchgeführt [32].Kurz gesagt, das Dimer der H131-Allel-FcγRIIa- oder V158-Allel-FcγRIII-Ektodomänen wurde in HEK293-Zellen exprimiert und unter Verwendung einer Größenausschlusssäule gereinigt, wie beschrieben [32].Für den FcγR-Bindungsassay wurde 1 μg/ml Antigen, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), auf ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden aufgetragen, gefolgt von einem Blockieren mit 1 % BSA in PBS.Die Serumproben wurden zweifach in einer Verdünnung von 1/500 getestet, gefolgt von der Zugabe von biotinylierter FcγRIIa- oder FcγRIII-Ektodomäne mit 0,2 μg/ml bzw. 0,1 μg/ml (alle in 1 % BSA zubereitet).Die FcγR-Bindung wurde unter Verwendung von Streptavidin nachgewiesen, das an Meerrettichperoxidase (HRP) bei einer Verdünnung von 1/10.000 in 1 % BSA konjugiert war.Die Vertiefungen wurden mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat inkubiert, gefolgt von 1 M Schwefelsäure, und die Extinktion wurde bei einer optischen Dichte (OD) von 450 nm gemessen.Die FcγRIII-Sonde repräsentiert die Bindungsaktivität von FcγRIIIa und FcγRIIIb.Polyklonales Kaninchen-IgG gegen CSP [31] wurde als positive Kontrolle verwendet, um die Platte-zu-Platte-Variabilität zu standardisieren, es wurde keine Serumkontrolle verwendet, um die Hintergrundreaktivität zu bestimmen, und Seren von Malaria-naiven erwachsenen Blutspendern aus Melbourne wurden als negative Kontrolle verwendet (Erhebung nach Einverständniserklärung).Positive Reaktionen wurden als Reaktivität definiert, die größer als der Mittelwert plus 3 × Standardabweichung der Kontrollproben aus Melbourne war.Wir haben auch die FcγR-Bindungseffizienzen relativ zu Gesamt-IgG wie folgt berechnet: OD FcγR-Bindung/OD IgG.IgG-, IgM- und IgG-Unterklassen wurden durch ELISA unter Verwendung von Standardmethoden in einer früheren Studie quantifiziert [17] und die Daten wurden in dieser Studie erneut analysiert.Die Isolierung von ganzen Leukozyten, Neutrophilen und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) aus peripherem Vollblut wurde mit etablierten Methoden durchgeführt [23].Ganze Leukozyten wurden durch Entfernen von Erythrozyten aus peripherem Blut unter Verwendung von Dextran-Segmentierung und hypotonischen Lyseansätzen isoliert.Gereinigte Leukozyten wurden in RMPI-1640 resuspendiert, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 2,5 % hitzeinaktiviertem Malaria-naiven Humanserum ergänzt war.Für die Isolierung von PBMC und Neutrophilen wurde peripheres Vollblut zuerst durch Gradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll Paque (GE Healthcare) getrennt.PBMCs wurden aus der Buffy-Layer gesammelt, gefolgt von 3 Waschgängen mit kaltem PBS, ergänzt mit 1 % neugeborenem Kälberserum.Neutrophile wurden aus dem Pellet durch Dextran-Segmentierungsanreicherung und hypotonische Lyse isoliert.Die gereinigten PBMCs und Neutrophilen wurden in RPMI-1640 resuspendiert, das mit 10 % fötalem Rinderserum bzw. 2,5 % hitzeinaktiviertem Malaria-naiven Humanserum ergänzt war.Fluoreszierende Latexkügelchen (Sigma-Aldrich) wurden unter Verwendung eines veröffentlichten Verfahrens [23] mit CSP in voller Länge beschichtet.Kurz gesagt, fluoreszierende Kügelchen mit Amingruppen-Modifikation auf der Oberfläche wurden zuerst mit Glutaraldehyd inkubiert, um als Linker zu dienen, gefolgt von einer weiteren Co-Inkubation mit CSP bei einer Konzentration von 1 mg/ml zur Antigen-Immobilisierung.Die antigenbeschichteten fluoreszierenden Kügelchen wurden mit Testseren in einer Verdünnung von 1/100 opsonisiert und dann mit Neutrophilen zur opsonischen Phagozytose für 20 min bei 37°C co-inkubiert.Neutrophile wurden unter Verwendung eines BD FACS Canto II-Durchflusszytometers analysiert (Gating-Strategie von Durchflusszytometriedaten wird in [23] berichtet).Der Grad der Phagozytose wurde als Phagozytoseindex ausgedrückt, der als Prozentsatz der Neutrophilen definiert war, die fluoreszierende Kügelchen aufgenommen hatten.Der Phagozytoseindex wurde weiter standardisiert als relativer Phagozytoseindex als Prozentsatz der positiven Kontrolle, die ein gegen CSP gezüchtetes polyklonales Kaninchen-IgG war [23].Als Kontrollen wurden Serumproben von nicht Malaria-exponierten Spendern mit Wohnsitz in Australien verwendet.Wir haben zuvor die Verwendung von Antigen-beschichteten Kügelchen anstelle von ganzen Sporozoiten als geeignetes Modell für opsonische Phagozytose etabliert [23].Die RTS,S-induzierte opsonische Phagozytose durch Neutrophile und Monozyten wurde mit einem etablierten Gesamtleukozyten-Assay verglichen [23].Kurz gesagt, CSP-beschichtete fluoreszierende Kügelchen wurden durch einen Pool von Seren, ausgewählt aus der RTS,S-Vakzinierungsgruppe, in variablen Konzentrationen vor der Co-Inkubation mit ganzen Leukozyten (isoliert unter Verwendung des obigen Verfahrens) opsonisiert.Die Co-Inkubation wurde bei 37°C mit 5% CO2 durchgeführt.Die Platten wurden am Ende der Co-Inkubation bei 4°C zentrifugiert und Neutrophile wurden mit Anti-CD66b-AF647 (BD Bioscience) und Monozyten mit Anti-CD14-APC-H7 (BD Bioscience) und Anti-CD16- gefärbt. BV421 (BD Bioscience), gefolgt von einer Quantifizierung der Phagozytose unter Verwendung eines BD FACS Verse-Durchflusszytometers.Die von Neutrophilen phagozytierten Kügelchen wurden als PE+- und CD66b+-Zellen definiert;die von Monozyten phagozytierten Kügelchen wurden als PE+- und CD14+-Zellen definiert.Die Anzahl der von Neutrophilen und Monozyten phagozytierten Kügelchen wurde basierend auf ihrer Fluoreszenzintensität quantifiziert und gemäß der Gesamtzahl von Phagozyten (Neutrophilen und Monozyten), die für jede Probe analysiert wurden, standardisiert.Zur Quantifizierung der opsonischen Phagozytose durch Monozyten und THP-1-Zellen wurden CSP-beschichtete fluoreszierende Kügelchen mit individuellen Serumproben aus der RTS,S-Impfstoffgruppe in einer Konzentration von 1/100 vor der Co-Inkubation mit THP-1-Zellen aus der Kultur opsonisiert oder isolierte PBMCs (enthält Monozyten) für 20 min.Monozyten wurden anschließend mit Anti-CD14-APC-H7 gefärbt und das Ausmaß der opsonischen Phagozytose wurde unter Verwendung eines BD FACS Canto II-Durchflusszytometers analysiert und als Prozentsatz von CD14+-Zellen bestimmt, die phagozytierte Kügelchen (PE+) aufweisen, und der relative Phagozytoseindex war berechnet als Prozentsatz relativ zur Positivkontrolle (Kaninchen-Anti-CSP-IgG) in derselben Platte.Über Assays unter Verwendung von THP-1-Zellen wurde bereits berichtet [23, 33].Standard-THP-1-Phagozytose-Assays wurden unter Verwendung etablierter Methoden durchgeführt, die 10 % fötales Kälberserum umfassen, und es wurden zusätzliche Assays durchgeführt, die 2,5 % Humanserum umfassten.Die Gating-Strategie von durchflusszytometrischen Daten für alle Zelltypen wird ausführlich in einer früheren Veröffentlichung beschrieben [23].Der ADCC-Assay wurde unter Verwendung einer zuvor veröffentlichten Methode durchgeführt [23].Kurz gesagt, PBMCs, die NK-Zellen enthielten, wurden über Nacht mit Interleukin-2 co-kultiviert.CSP-beschichtete Kügelchen wurden mit einem Pool von Seren opsonisiert, die aus der RTS,S-Impfgruppe ausgewählt wurden.Die opsonisierten Kügelchen wurden mit den geprimten PBMC und Anti-CD107a-AF647 für 1 h co-kultiviert, gefolgt von der Zugabe von Brefeldin A (Sigma-Aldrich) und Proteintransportinhibitor (BD Bioscience) und weiter für 3 h co-kultiviert.Nach der Kokultur wurden die Zellen mit Anti-CD3-APC-H7 (SK7, BD Bioscience), Anti-CD56-PE-Cy7 (B159, BD Bioscience) und Anti-CD16-BV421 (3G8, BD Bioscience) gefärbt.NK-Zellen wurden als CD3−, CD56+ und CD16+ definiert, und der ADCC-Spiegel wurde als Prozentsatz der NK-Zellen quantifiziert, die für eine CD107a-Färbung durch Durchflusszytometrie positiv waren (LSR Fortessa X-20, BD Bioscience; Gating-Strategie ist in gezeigt eine frühere Veröffentlichung [23]).Neutrophile wurden aus frisch entnommenem venösem Blut unter Verwendung des EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit (STEMCELL) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und am selben Tag wie die Entnahme verwendet.Die Reinheit der Neutrophilen wurde durch Zellmorphologie unter Verwendung von Lichtmikroskopie von Giemsa-gefärbten Objektträgern der isolierten Zellen bewertet, und die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen wurde unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss bewertet.CSP wurde auf weiße Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (NUNC) mit 4 &mgr;g/ml in PBS aufgetragen und über Nacht in Parafilm eingewickelt in einer feuchten Box bei 4°C belassen.Die Flüssigkeit wurde dann entfernt und die Platten wurden mit PBS gewaschen, gefolgt von Blockieren mit PBS 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich) für 1 h bei Raumtemperatur.Testserumproben (Verdünnung 1/25 in PBS), nicht Malaria-exponierte Melbourne-Kontrollen (Verdünnung 1/25 in PBS), keine Seren (25 μl PBS) oder polyklonale Kaninchen-Anti-CSP-Antikörper der Positivkontrolle (Verdünnung 1/500). in PBS) wurde dann in jede Vertiefung gegeben und 1–2 h bei Raumtemperatur belassen, die Platten wurden dann 2 Mal mit PBS gewaschen.Unmittelbar vor der Zugabe zu der Platte wurden isolierte Neutrophile in Hanks-gepufferter Salzlösung bei 2 × 10 6 /ml resuspendiert und 20 &mgr;l Zellen wurden zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von 20 &mgr;l PBS mit 33 ng/ml HRP und 4 mM Luminol ( alles von Sigma).Die Platte wurde zum Absetzen des Inhalts zentrifugiert und dann sofort auf einem FLUOstar-Plattenlesegerät gelesen.Die Lumineszenz wurde in jeder Vertiefung für 1 s alle 2 min für 1 h gemessen und wurde als die durchschnittliche Lumineszenz 5 min zu beiden Seiten der Spitze der Kurve berechnet.Jede Platte wurde unter Verwendung der Kaninchen-anti-CSP- und PBS-Kontrollen standardisiert, die in zweifacher Ausfertigung auf jeder Platte enthalten waren.Die relative Lumineszenz wurde für jede Probe als Prozentsatz relativ zur positiven Kontrolle derselben Platte berechnet.Alle Daten wurden in Excel-Tabellen eingegeben und anschließend zur statistischen Analyse in Stata SE 13.1 importiert.RTS,S-induzierte Reaktionen (M0 gegenüber M3) wurden mit dem gepaarten Wilcoxon-Rangsummentest, dem Wilcoxon-Rangsummentest für ungepaarte Daten und Kruskal-Wallis-Tests für Antikörperparameter zwischen mehr als 2 Gruppen verglichen.Spearmans Korrelation wurde verwendet, um die Korrelation zwischen Antikörperparametern zu analysieren.Gegebenenfalls wurden andere spezifische Tests verwendet.Für alle Analysen werden die verwendeten p-Werte und statistischen Tests in Abbildungslegenden und in Tabellen angegeben.Angesichts der Nicht-Normalverteilung der Daten und des Vorhandenseins von Nullwerten wurde eine verallgemeinerte lineare gemischte Modellierung (GLMM; Poisson-Verteilung und Log-Link-Funktion) verwendet, um latente Wachstumskurvenmodelle zu schätzen, die die fachspezifische Natur des Zusammenhangs zwischen der Zeit untersuchen und die Größe und Funktionen von Antikörpern.Verallgemeinerte latente Wachstumskurvenmodelle wurden für jede IgG-Subklasse und jeden funktionellen Antikörperparameter unter Verwendung von linearen Splines geschätzt (basierend auf den Messintervallen der Studie);hiermit wurde die funktionale Form des Zeiteinflusses (pro Monat) modelliert.Die spezifische Anzahl der Keile, die für jedes Modell angebracht wurden, basierte auf einer visuellen Interpretation der funktionellen Form.Latente Wachstumskurvenmodelle umfassten zwei Ebenen, Individuen auf Ebene 2 (d. h. zufälliger Schnittpunkt und Koeffizient für linearen Spline, begrenzt auf den 3-Monats-Zeitraum angesichts der beobachteten Heterogenität bei Induktion und Schätzung/Modellkonvergenz/Leistung und Sparsamkeitsbetrachtungen) und ihre Ebenen und Funktionen von Antikörperantworten über die Zeit auf Level-1.Nichtlineare Gleichungen nach der Schätzung wurden verwendet, um die Halbwertszeit des Ergebnisses zu schätzen und 95 % Konfidenzintervalle für diese Schätzungen bereitzustellen.Die Induktions- und Zerfallsraten von Antikörpern wurden für jedes bei der Modellierung verwendete parameterspezifische Zeitintervall geschätzt.Das GLMM erzeugte Ratenverhältnisse (RR) und angepasste Ratenverhältnisse (ARR), die die prozentuale Veränderung der Antikörpergröße oder funktionellen Aktivität für jeden Monat Anstieg im Laufe der Zeit für die jeweiligen Splines darstellen;dh RR <1 zeigt eine Abnahme an (1 – RR × 100 ergibt % Abnahme) und >1 zeigt eine Zunahme an (RR – 1 × 100 ergibt % Zunahme).Um die longitudinalen Assoziationen zwischen der Größe und Funktion von Antikörpern abzuschätzen, wurden latente Wachstumskurvenmodelle erweitert, um neben linearen Splines (die die funktionelle Form des Zeiteffekts modellieren) auch Kovariaten einzubeziehen, wobei nicht angepasste und angepasste Effekte geschätzt wurden.RR und ARR wurden geschätzt und stellen die prozentuale Änderung in der Größe eines Antikörperparameterergebnisses für jede Einheitszunahme des kovariaten Parameters dar (z. B. prozentuale Änderung der FcγRIIa-Bindung für jede Einheitszunahme von IgG1).Modellwahrscheinlichkeitsbasierte informationstheoretische Kriterien (Akaike Information Criteria [AIC] und Bayesian Information Criteria [BIC]) wurden verwendet, um die Anpassungsverbesserung des Modells zu bestimmen, wenn die Zeit als zufälliger Effekt (dh zufällige Steigung für Splines) geschätzt wurde.Um auch die Eignung der geschätzten latenten Wachstumskurvenmodelle zu beurteilen, wurden diagnostische Diagramme erstellt und untersucht, in denen die beobachteten Antikörperspiegel der Teilnehmer mit den auf dem Bayes'schen Modell basierenden (Best Linear Unbiased Predictions) vorhergesagten Spiegeln im Laufe der Zeit verglichen wurden.Bei allen statistischen Modellen basierten die Wahrscheinlichkeitswerte auf Wald-Statistiken, und der Huber/White-Sandwich-Varianzschätzer (dh robuster Standardfehler) wurde angegeben, da die bedingte Varianz wahrscheinlich nicht der mittleren Erwartung in diesen Daten entspricht.Die statistische Inferenz wurde auf dem 5%-Niveau bewertet.Das statistische Paket Stata Version 15.1 (StataCorp LP, College Station, TX) wurde bei allen statistischen Modellierungen verwendet.Kinder erhielten drei RTS,S-Impfstoffdosen (in den Monaten 0, 1 und 2 der Studie) und wir verglichen zunächst Antikörper in Proben, die in Monat 3 (M3) gesammelt wurden, mit Proben vor der Impfung, die zu Studienbeginn (M0) gesammelt wurden.Kinder in der RTS,S-Gruppe hatten nach der Impfung (M3) im Vergleich zum Ausgangswert (M0) oder der Vergleichsgruppe ohne Malaria-Impfstoff eine signifikant erhöhte Antikörper-vermittelte FcγRIIa-Bindung und FcγRIII (IIIa und IIIb)-Bindungsaktivität, die auf CSP abzielt sowohl die Studienzentren Manhiça als auch Ilha Josina (p < 0,001 für alle Tests; Abb. 1A, B; Zusätzliche Datei 1: Abb. S1A und S1B).Zu Studienbeginn (M0) hatten nur wenige Kinder Antikörper gegen CSP erworben, die im Allgemeinen von geringer Stärke waren.Zu beachten ist, dass das Ausmaß der FcγR-Bindungsaktivität bei Kindern stark variierte und einige Kinder wenig oder kein IgG mit FcγR-Bindungsaktivität entwickelten.RTS,S-Impfstoff-induzierte Antikörper interagieren mit FcγRs.Serumproben von Kindern in der RTS,S-Impfstoffgruppe aus den Studienzentren Manhiça (blaue Kästchen, n = 50) und Ilha Josina (orange Kästchen, n = 49) wurden auf Antikörper getestet, die FcγRIIa binden (linke Felder; A, C , E) und FcγRIII (rechte Tafeln; B, D, F).Proben, die zu Studienbeginn (Monat 0, M0) und nach der dritten Impfung (Monat 3, M3) entnommen wurden, wurden gegen A, B CSP in voller Länge, C, D Central-Repeat (NANP) und E, F C-terminal (CT ) Regionen von CSP.Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) mit Median (Balken) dar, und Schnurrhaare stellen die höchsten und niedrigsten Werte innerhalb von 1,5 × IQR dar.Werte auf der Y-Achse geben die optische Dichte (OD) bei 450 nm an.Der Prozentsatz der Kinder mit positiver Reaktion ist in Zusatzdatei 1: Abbildung S1 dargestellt, und die Reaktivitäten zwischen gepaarten Proben wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummentests verglichenRTS,S-induzierte Antikörper, die für die NANP- und CT-Regionen von CSP spezifisch sind, könnten die Bindung von FcγRIIa und FcγRIII im Vergleich zu M3 mit M0 oder im Vergleich zur Vergleichsimpfstoffgruppe fördern (p < 0,001 für alle Tests; Abb. 1C–F und zusätzliche Datei 1: Abb. S1C-F).Diese Beobachtung war an den Studienstandorten Manhiça und Ilha Josina konsistent.Wir bewerteten die FcγRIIa- und FcγRIII-Bindungsaktivität relativ zu IgG für Reaktionen, die für jede Region von CSP spezifisch sind, was als FcγR-Bindungseffizienz bezeichnet wurde.RTS,S-induziertes IgG gegen NANP hatte eine höhere FcγRIIa- und FcγRIII-Bindungseffizienz im Vergleich zu IgG gegen die CT-Region (jeweils p < 0,001, Zusatzdatei 1: Abb. S2).Kürzlich wurde festgestellt, dass die opsonische Phagozytose von Sporozoiten hauptsächlich durch Neutrophile vermittelt wird [23].Bei der Auswertung einer Auswahl von Kindern in der Manhiça-Kohorte stellten wir fest, dass RTS,S-Impfstoff-induzierte Antikörper die neutrophile opsonische Phagozytose von CSP-beschichteten Kügelchen (ein etablierter Ersatz für Sporozoiten in Phagozytose-Assays [23]) förderten (p < 0,001 für M3 vs. M0 ; Abb. 2A).Das Ausmaß der opsonischen Phagozytose-Aktivität war jedoch bei Kindern sehr unterschiedlich (mittlerer relativer Phagozytose-Index (RPI) 35,08, Interquartilbereich (IQR) 14,5–48,4 %).Darüber hinaus induzierten diese Antikörper einen Antikörper-abhängigen respiratorischen Burst durch Neutrophile, was auf eine Aktivierung von Neutrophilen und das Potenzial für zelluläre Zytotoxizität hindeutet [34] (p = 0,011 für M3 vs. M0; Abb. 2B).RTS,S-Impfstoff-induzierte Antikörper förderten auch die opsonische Phagozytose von CSP-beschichteten Kügelchen durch die THP-1-Monozyten-Zelllinie, die üblicherweise als Modell für Monozyten-Phagozytose in vitro verwendet wird (Abb. 2C) [19, 20, 23, 33 , 35, 36].Wir bestätigten, dass Antikörper auch die Phagozytose mit primären menschlichen Monozyten, die aus peripherem Blut gereinigt wurden, wirksam förderten (Abb. 2D).Frühere Studien berichteten, dass die opsonische Phagozytose durch THP-1-Zellen weitgehend durch FcγRI vermittelt wurde und dass die Phagozytoseaktivität teilweise durch unspezifisches monomeres IgG gehemmt wurde, das im menschlichen Serum vorhanden ist und an FcγRI auf Phagozyten binden kann [23].Um diesen Effekt zu untersuchen, testeten wir einen Probenpool von RTS,S-geimpften Kindern auf opsonische Phagozytose von CSP-beschichteten Kügelchen durch THP-1-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von nicht-immunem Humanserum als Quelle für unspezifisches IgG .THP-1-Zellen konnten immer noch eine beträchtliche opsonische Phagozytose in Anwesenheit von nicht-immunem Humanserum fördern, obwohl das Ausmaß wesentlich verringert war (Fig. 2E).Wir untersuchten ferner die relative Aktivität von Neutrophilen und Monozyten bei der opsonischen Phagozytose in einem Ganzleukozyten-Assay mit frischem Blut unter Verwendung eines Pools von Proben von M3 gegenüber M0 (Abb. 2F).Die Rate der Phagozytose (Anzahl der pro Zelle phagozytierten Kügelchen) war bei Neutrophilen viel höher als bei Monozyten, was unserer früheren Beobachtung einer höheren Aktivität von Neutrophilen mit natürlich erworbenen Antikörpern bei Erwachsenen und CSP-spezifischen Kaninchen-Antikörpern ähnelt [23] Phagozytoserate stieg mit steigenden Antikörperkonzentrationen für Neutrophile und Monozyten an und blieb für Neutrophile höher.Zuvor wurde berichtet, dass Antikörper gegen CSP die NK-Zellaktivität durch Wechselwirkung mit FcγRIIIa fördern können [18, 23].Hier haben wir bestätigt, dass RTS,S-induzierte Antikörper die für die ADCC-Aktivität charakteristische NK-Zellaktivierung induzieren können, indem wir gepoolte Proben von M3 mit M0 verglichen (Abb. 2G).RTS,S-Impfstoff-induzierte Antikörper vermitteln zelluläre Immunantworten.A–C Serumproben von Kindern in der RTS,S-Impfstoffgruppe (Manhiça-Kohorte), die zu Studienbeginn (Monat 0, M0) und nach der Impfung (Monat 3, M3) entnommen wurden, wurden auf die Fähigkeit getestet, die opsonische Phagozytose von CSP-beschichtetem A zu fördern Kügelchen durch Neutrophile (n = 30), B-Antikörper-abhängiger respiratorischer Burst (OD-Einheiten) durch Neutrophile gegen CSP (n = 15), C opsonische Phagozytose von CSP-beschichteten Kügelchen durch THP1-Zellen (n = 30).D Opsonische Phagozytose durch primäre Monozyten (n=37 (22 von Manhica, 15 von Ilha Josina Kohorte)).Die Daten werden als Boxplots dargestellt, wobei die Boxen den Interquartilbereich (IQR) mit dem Median (Balken) darstellen und Whisker die höchsten und niedrigsten Werte innerhalb von 1,5 × IQR darstellen.Die Reaktivitäten zwischen gepaarten Proben wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Matched-Pairs-Vorzeichen-Rang-Tests verglichen.Die Phagozytose wird als Prozentsatz relativ zu einer positiven Kontrolle (Kaninchen-IgG gegen CSP) angegeben, ADRB wird als Lumineszenzeinheiten gemessen.E Gepoolte Proben von M0 (blaue Linien oder Balken, n=99) und M3 (rote Linien oder Balken, n=99) wurden auf opsonische Phagozytose von CSP-beschichteten Kügelchen durch THP-1-Zellen in Gegenwart (gestrichelte Linien) und getestet Fehlen (durchgezogene Linien) von nicht-immunem Humanserum (HS).Punkte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler aus zwei unabhängigen Experimenten dar.F Gepoolte Proben von M0 und M3 (n = 99) wurden in einem Ganzleukozyten-Assay auf opsonische Phagozytose durch Neutrophile und Monozyten getestet.Die Daten zeigen die Anzahl der CSP-beschichteten Kügelchen, die von 100 Zellen phagozytiert wurden.Punkte und Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert und den Standardfehler aus zwei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von Blut von zwei Spendern.Die Phagozytose war bei Neutrophilen höher als bei Monozyten (P = 0,003, Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen).G Dieselben gepoolten Proben von M0 und M3 wurden auf die Aktivierung von NK-Zellen getestet, was auf eine ADCC-Aktivität hinweist.Die Y-Achse gibt den Prozentsatz der NK-Zellen an, die für eine CD107a-Färbung durch Durchflusszytometrie positiv waren (P < 0,001, Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen).Punkte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler dar, basierend auf Daten aus 4 Experimenten (verschiedene NK-Zellspender)Weltgesundheitsorganisation.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch 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