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2022-11-10 12:01:01 By : Ms. kerry wei

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B. Autoimmunerkrankungen) wird häufig die Proteomik1,2,3,4 in die Suche nach Biomarkern einbezogen, und zufällige Peptid-/Peptoid-Mikroarrays haben gelegentlich auch Erfolge erzielt2,5,6.Umgekehrt ist bei Infektionskrankheiten, die durch Parasiten, Bakterien oder Viren verursacht werden, klar, wo nach Biomarkern gesucht werden muss: entweder Antigene von Krankheitserregern oder Antikörper im Serum.Obwohl der parasitologische Nachweis (z. B. dicke Abstriche oder PCR) immer noch der Goldstandard für die Diagnose von Infektionskrankheiten ist, ist er aufgrund der hohen technischen Anforderungen der Bediener und des zeitaufwändigen Verfahrens für eine groß angelegte Krankheitsüberwachung ungeeignet.Der Protein-Biomarker-basierte Schnelldiagnostiktest (RDT) wird häufiger verwendet.Die Diagnose von P. falciparum-Malaria basierte typischerweise auf dem Nachweis eines P. falciparum-spezifischen Antigens, nämlich des histidinreichen Proteins II (P. falciparum HRPII)7,8 mit passenden monoklonalen Antikörpern (mAbs; Abb. 1a).Diese traditionelle Strategie stützt sich stark auf die Entdeckung artspezifischer Antigene, was eine lange und kostspielige Reise voller Ungewissheiten sein könnte1,8,9,10.Darüber hinaus könnten sowohl genetische als auch immunogene Variationen zu falschen Negativen für solche Antigen-basierten Immunoassays führen.Beispielsweise exprimieren etwa 5 % von P. falciparum das P. falciparum-HRPII-Gen nicht von Natur aus8,11.Wir haben festgestellt, dass 7,6 % der Patienten tatsächlich HRPII-Antikörper tragen (erweiterte Daten, Abb. 1) und dass sie auch für den HRPII-Nachweis negativ sind, was zu insgesamt 12,6 % intrinsisch falsch-negativen Ergebnissen führt.Bei einem anderen diagnostischen Biomarker für Malaria, Laktatdehydrogenase, wurden ebenfalls neutralisierende Antikörper gefunden (Erweiterte Daten, Abb. 1), was impliziert, dass alle Protein-Biomarker aufgrund des Vorhandenseins neutralisierender Antikörper mit solchen intrinsischen falsch-negativen Problemen konfrontiert sind.Kurze Darstellung des Auffindens diagnostischer Epitope in vier Schritten (DEIFS).Motiviert durch die intrinsischen Einschränkungen von Protein-Biomarkern (a), wurden Epitop-basierte Diagnosen vorgeschlagen und von DEIFS realisiert (b): 1. Bibliothekskonstruktion, Proteinkandidaten wurden ausgewählt und in eine 30/15 aa überlappende Peptidbibliothek übersetzt;2. Zwei-Runden-Screening, 30/15 aa überlappende Peptidbibliothek wurde durch Trainingsgruppenserum gescreent und durch Drei-Modus-Analyse eingegrenzt.Ausgewählte Peptide wurden einem 15/12 aa überlappenden zweiten Runden-Screening auf Epitop-Pinning unterzogen;3. Optimierung der Epitopkombination.Peptide wurden durch SAM- und Cluster-Algorithmus weiter eingegrenzt und für die Diagnose nach dem Dsum-Prinzip optimiert;4. Validierung, chimäre Peptide wurden aus diagnostischen ECPs für schnelle diagnostische Tests erzeugt.Der gesamte Prozess könnte in drei Monaten durchgeführt werden und je nach Bedarf zwischen High-Content- und High-Density-Modus wechseln.Abbildung 2, 3, 4, 5 geben weitere Einzelheiten zu jedem der vier Schritte.(c) Durchführung der Epitopdiagnose basierend auf DEIFS.Es wurden Sensitivität und Spezifität von 94,7 % bzw. 99,1 % erreicht.Antikörper im Serum sind ideale Biomarker für die Diagnose, um das oben beschriebene falsch-negative Problem zu vermeiden.Epitope als die Antikörpererkennungsregion des Antigens könnten für den Antikörpernachweis verwendet werden.Der diagnostische Wert wurde lange vorhergesagt, aber nicht realisiert.Viele Epitope wurden in umfangreichen Studien über Malaria identifiziert12,13,14,15, jedoch werden keine Epitop-basierten Diagnosewerkzeuge verwendet.Wir führen dies auf vier Probleme zurück: (1) technische Schwierigkeiten beim groß angelegten Seroscreening von Peptid-Mikroarrays;16 (2) begrenzte Anzahl von linearen Epitopen17, die als Biomarker von einem einzelnen Protein verfügbar sind;(3) die Komplexität von Antikörpern im Serum;18 und (4) Immundiversität, die einen Widerspruch zwischen Sensitivität und Spezifität verursacht19.Alle diese vier Hindernisse können durch die Verwendung von DEIFS überwunden werden, einem standardisierten Verfahren, das nicht nur allgemein, sondern auch praktisch ist, um Epitopkombinationen von diagnostischem Wert zu finden.Abbildung 1b fasst die vier Schritte von DEFIS zusammen und der Rest des Papiers wird die Methode sehr detailliert beschreiben.Für den ersten Schritt von DEIFS wurden 38 P. falciparum-Proteine ​​(Abb. 2b und erweiterte Datentabelle 1) ausgewählt und in 2038 überlappende Peptide für den Aufbau einer Kandidatenbibliothek aufgeteilt.Diese 2038 überlappenden Peptide wurden auf eine iPDMS-Membran gedruckt, um einen Microarray-Chip für den zweiten Schritt von DEIFS zu bilden, ein Seroscreening in zwei Runden, das für eine Trainingsgruppe durchgeführt wurde (125 gesunde und 289 mit P. falciparum infizierte Seren).Die iPDMS-Membran bietet selbst ohne Blockierungsbehandlung einen nahezu „null“ Hintergrund für serologische Assays (Abb. 2e,f).Mit dieser einzigartigen Funktion waren die Datenerfassung und -analyse einfach20 (erweiterte Daten, Abb. 2): Die Chemilumineszenzintensität wurde von einer CCD-Kamera für jeden Punkt des Mikroarrays erfasst, die dann in das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) umgewandelt wurde.Diese Originaldaten könnten verwendet werden, um die folgende bioinformatische Analyse durchzuführen.Damit haben wir das erste Problem gelöst: technische Schwierigkeiten beim groß angelegten Seroscreening von Peptid-Mikroarrays.Die Lösung für das zweite Problem war die Verwendung mehrerer Proteine, wie unten gezeigt, wodurch man genügend Epitope für die Diagnose erhalten konnte.Sowohl Antigen als auch Antikörper können das Ziel des Nachweises sein.(a) P. falciparum-spezifisches Antigen kann durch Sandwich-Immunoassay nachgewiesen werden, um eine Infektion anzuzeigen.(b) Epitope sind immundominante Regionen von Antigenproteinen, die mit Antikörpern interagieren können.Antigene wurden in überlappende Peptide (30 Aminosäuren lang mit 15 überlappenden Aminosäuren) unterteilt, die auf iPDMS-Membranen gedruckt wurden, um Mikroarrays zu bilden.(c) Eine Wärmekarte von 304 Seren (179 mit P. falciparum infiziert, 125 gesund) zu 2038 Peptiden wurde durch direktes Umwandeln von SNR in Graustufen erhalten.(d) Bei groß angelegtem Seroscreening führten spezifische Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen zu einem Bereich mit hoher Signalintensität auf der Wärmekarte.(e) Repräsentatives Ergebnis von mit P. falciparum infiziertem Serum.(f) Repräsentatives Ergebnis aus gesundem Serum.Die erste Runde des Seroscreenings verwendete Peptide mit einer Länge von 30 Aminosäuren (aa) mit 15 überlappenden aa (nachfolgend als 30/15 aa abgekürzt).Eine Wärmekarte wurde erhalten, indem der resultierende SNR-Wert in Graustufen umgewandelt wurde (Abb. 2b–d).Die Signifikanzanalyse von Microarrays (SAM), die in der DNA-Microarray-Analyse weit verbreitet ist, schnitt bei den Peptid-Microarrays schlecht ab, wenn sie direkt auf den groß angelegten Originaldaten der Peptid-Microarrays verwendet wurde (erweiterte Datentabelle 3).Hier führten wir eine „Drei-Modus-Analyse“-Methode ein (Abb. 3), die die Identifizierung von Epitop-enthaltenden Peptiden (ECPs) erleichterte.Drei-Modus-Analyse und Zwei-Runden-Screening-Strategie zur Identifizierung von ECPs.(a) Beispielsweise wurden die Modi 010, 011 und 111 jeweils mit roten, blauen und grünen Kästchen angezeigt.(b) Ein Peptid mit dem 010-Modus oder 011/110-Modus wies auf ein einzelnes Epitop im 30 aa-Peptid hin.Ein Peptid mit dem 111-Modus zeigte an, dass das Protein mehr als ein einzelnes Epitop in dem 30 aa-Peptid enthält.(c) Für jedes Serum erhielt jedes Peptid einen SNR-Wert nach Seroscreening (als Beispiel wurde Protein Px in 4 Peptide aufgelöst und mit 4 Seren umgesetzt, die Se1, Se2, Se3 und Se4 sind).Die SNR-Matrix des Proteins Px wurde zu Beginn der Drei-Modus-Analyse in eine (d) 1/0-Matrix umgewandelt.(e) Nach der Modusidentifizierung wurde die 1/0-Matrix in (f) eine Modustypmatrix umgewandelt, die dann (g) statistisch analysiert wurde, um (h) die Behandlung zu visualisieren.Das Liniendiagramm mit Punkten stellt die Abdeckung von 3 verschiedenen Modi dar, nämlich 010 (h, rote Linie), 011/110 (h, blaue Linie) und 111 (h, grüne Linie).Das Flächendiagramm (h, graue Fläche) repräsentiert die Gesamtabdeckung aller 3 Modi.Die Drei-Modus-Analyse ergab Epitop-enthaltende Peptide (ECPs).Die Drei-Modus-Analyse von P28 (i), P18 (j) und P07 (k) sind typische Fälle, die ECPs aus drei verschiedenen Modi aufdecken.Ausgewählte ECPs wurden einem Screening der zweiten Runde (15/12 Aminosäuren) auf Epitop-Pinning unterzogen.Verschiedene Modi zeigten unterschiedliche Epitop-Orte: Typ 010 in der Mitte (l), Typ 011/110 in den gemeinsamen Teilen von zwei benachbarten 30 aa-Peptiden (m) und Typ 111 stellte eine Reihe von Epitopen dar, die wiederholt in 3 aufeinanderfolgenden Peptiden lokalisiert waren (n) .Die identifizierten Epitopsequenzen wurden ausgewählt, um chimäre Peptide herzustellen.Zunächst wurden zur Vereinfachung des Algorithmusdesigns SNR-Werte größer als der Cutoff (SNR ≥ 2) in 1 konvertiert, andernfalls in 0. Als Ergebnis wurde die SNR-Matrix (Serum vs. Peptide) in eine 1/0-Matrix konvertiert (Abb. 3c,d).Zweitens wurden drei aufeinanderfolgende Peptide entlang der Proteinsequenz als eine Einheit untersucht.Die erste Analyseeinheit befand sich im festen Rahmen Px-01 bis Px-03 (Abb. 3e).Die zweite Analyseeinheit war in gestrichelten Rahmen, Px-02 bis Px-04 und so weiter.Theoretisch gibt es sechs Kombinationen (dh Modi) für drei aufeinanderfolgende Werte, nämlich 000, 001/100, 010, 011/110, 101 und 111. Diese sechs Modi sind jedoch nicht analytisch äquivalent.Wir haben den Prozentsatz der Seren berechnet, die zu jedem Modus gehören, wie im Linien-/Flächendiagramm (Abb. 3h) gezeigt.Wir haben uns nur auf die Abdeckung von drei einzigartigen Modi für die Epitopidentifizierung konzentriert: nämlich die 010-, 011- und 111-Modi, die in Abb. 3a durch rote, blaue und grüne Kästchen gekennzeichnet sind.Die Abdeckung der 000-, 001/100- und 101-Modi wurde als 0 bezeichnet, da der 000-Modus keinen Beitrag zur Epitopidentifizierung leistete und die 001/100- und 010-Modi durch die 010- oder 011/110-Modi dargestellt werden konnten.Jeder der drei Modi repräsentiert eine Form der Epitoplokalisierung (Abb. 3b).Wir können ECPs leicht anhand des Linien-/Flächendiagramms der Drei-Modus-Analyse identifizieren.Wir analysierten alle 38 Proteine ​​durch Drei-Modus-Analyse (erweiterte Daten, Fig. 3), da ein ECP als ein Peptid mit hohem SNR für die Mehrheit der infizierten Serumproben definiert ist.Der Cutoff-Wert für die Abdeckung wurde willkürlich auf 20 % gewählt, wie die gestrichelten Linien in Abb. 3i–k zeigen.Peaks über der gestrichelten Linie zeigten die Position der ECPs an.Ein Peptid mit dem 010-Modus oder 011/110-Modus wies auf ein einzelnes Epitop im 30 aa-Peptid hin (Abb. 31, m).Ein Peptid mit dem 111-Modus zeigte an, dass das Protein eine Wiederholungssequenz von ECPs enthält (Fig. 3n).Der schattierte Bereich hinter dem Liniendiagramm zeigt die Gesamtabdeckung der drei Modi an.Für die Diagnose werden ECPs mit hoher Abdeckung der 010- oder 011/110-Modi und einer ähnlichen Abdeckung des Schattenbereichs bevorzugt, was auf ein einzelnes Epitop mit hoher Empfindlichkeit hinweist.Darüber hinaus spiegelte die Beziehung zwischen dem Liniendiagramm und dem Flächendiagramm (d. h. der graue Schatten) die Komplexität der Epitopzusammensetzung wider: wenn ein ECP eine geringe Abdeckung von jedem der drei Modi, aber eine hohe Abdeckung insgesamt aufweist (d. h. Flächendiagramm ), können wir schlussfolgern, dass die multiplen Epitope in diesem ECP enthalten waren.Obwohl diese Epitope aufgrund unzureichender Sensitivität wenig zur Diagnose beigetragen haben, könnten sie einen Hinweis auf die Erforschung der Pathogenese geben: Warum zeigen Patienten unterschiedliche Immunantworten, wenn sie an der gleichen Pathogeninvasion leiden?Unter Verwendung der Drei-Modus-Analyse wurden nur 153 von 2038 Peptiden als ECPs identifiziert.Diese Rate von 7,4 % ist ein Durchschnitt von 38 P. falciparum-Proteinen (erweiterte Datentabelle 3), was mit dem zuvor berichteten Wert von 2 % linearer B-Zell-Epitope übereinstimmt17.Nur diese 153 Peptide wurden weiter dem Seroscreening der zweiten Runde unterzogen, wobei 15 Aminosäuren mit 12 Aminosäuren überlappende Peptide verwendet wurden, um die Position der Epitopsequenzen festzulegen, was die Zuverlässigkeit unserer „Drei-Modus-Analyse“-Methode zur Identifizierung von Epitopen bestätigte.Zum Beispiel (gezeigt in Abb. 3l–n) ist P28-87 ein Peptid mit einer hohen Abdeckung von Modus 010. Das Screening der zweiten Runde ergab die „TYLTEPILTEEHF“-Sequenz als Epitopsequenz.In ähnlicher Weise wies P18-028 eine hohe Abdeckung des Modus 110/011 auf und sein Epitop befand sich in der gemeinsamen Sequenz „'PEPTVTNEE“.P7-059 wies eine hohe Abdeckung von Modus 111 auf und war eines der Peptide, die in der stark wiederholten Sequenz von „KNEKVEHEIVEVEEILPE“ für P7 enthalten waren.Wir kamen zu dem Schluss, dass die „IVEVEEI“-Sequenz für die Antikörpererkennung wesentlich ist, was von Michael et al.mit Phagen-Display12.Nach der Reduzierung von 2038 Peptiden auf 153 ECPs durch die Drei-Modus-Analyse (erweiterte Datentabelle 3) gelang es SAM, Peptide zu extrahieren, die unterschiedliche Reaktionsraten für verschiedene Serumuntergruppen zeigen (Abb. 4a): Insgesamt 72 ECPs wurden als hochgradig ansprechend ausgewählt Peptide in P. falciparum-positiven Proben und wurden geclustert (Fig. 4b).ECPs mit der höchsten Abdeckung an positivem Serum aus jeder Clustergruppe wurden ausgewählt.Zur weiteren Optimierung haben wir die Gesamtabdeckung dieser ECPs berechnet.Acht ECPs (Tabelle 1) wurden schließlich als diagnostische Kandidaten identifiziert.Die 8 ausgewählten ECPs aus mehreren Proteinen schnitten basierend auf dem traditionellen SNR-Cutoff-Wert schlecht ab (Abb. 4c, d und erweiterte Daten, Abb. 4 und 5 und Tabelle 4), wobei SNR ≥ 2 ein positives Ergebnis anzeigte.Keine der 8 ECPs kann eine zufriedenstellende Sensitivität (> 90 %) der Diagnose liefern.Nur 2 der 8 ECPs konnten 100 % Spezifität erreichen, was aufgrund der Komplexität der Antikörper im Serum Mimotopen oder molekularen Mimetika zugeschrieben wurde.Wenn wir die traditionelle Strategie des Multiplexing verwenden würden, dh wenn einer der 8 ECPs positiv ist, zeigt dies an, dass das Serum positiv ist21, würde man eine erhöhte Sensitivität von 97,2 %, aber eine schlechte Spezifität von 86,4 % finden.Wir glauben, dass dieser Widerspruch zwischen Sensitivität und Spezifität die Realisierung des lange vorhergesagten diagnostischen Werts von Epitopen behindert hat.Eine Binärisierungs-/Digitalisierungsstrategie wurde entwickelt, um es den 8 ausgewählten ECPs zu ermöglichen, eine diagnostische Funktion zu erreichen, eine Lösung für das dritte und vierte Problem.Optimierung der Epitopkombination.(a) SAM-Plot von 153 ausgewählten Peptiden aus mit P. falciparum infizierten und gesunden Proben.In roten Kreisen sind insgesamt 72 Peptide mit signifikant unterschiedlichem SNR in infizierten und gesunden Proben dargestellt.(b) Die Wärmekarte dieser 72 Peptide wurde geclustert und 8 Peptide wurden aus jedem Cluster ausgewählt.(c) Violinplot von 3 ausgewählten Peptiden (P25-040, P23-027 und P34-088).(d) ROC-Kurve jedes der 3 Peptide und aller 8 Peptide.Obwohl diese Peptide eine hohe Spezifität aufweisen (99,2 %, 93,6 % und 98,0 %), hat keines eine zufriedenstellende Sensitivität (66,5 %, 79,9 % und 75,4 %).Zuerst haben wir einen universellen binären Cutoff-Wert von SNR = 2 als Hinweis darauf definiert, dass wir ansprechbar sind (Erweiterte Daten, Abb. 2c–e).Bei mehr als 10.000 getesteten Microarrays betrug das mittlere SNR der leeren Punkte (dh mit Puffer gedruckte negative Kontrollpunkte) 0,5 ± 0,3, sodass der Wert von (leer + 3 std) ungefähr 1,4 beträgt.Wir haben 2 als strengen und konservativeren Grenzwert gewählt.Dieser stabile Hintergrundwert nahe Null ist entscheidend für die Binarisierungsbehandlung: Wenn ein Peptid ein SNR < 2 hat, weisen wir Di = 0 zu;wenn SNR ≥ 2, Di = 1, wobei D die digitale Diagnose darstellt und i ein Peptid darstellt.Wir beurteilen nicht, ob diese Reaktion auf eine bestimmte Interaktion zurückzuführen ist.Tatsächlich könnte ein SNR von 2 auf niedrige Konzentrationen spezifischer Antikörper (dh spezifische Wechselwirkung) zurückzuführen sein, ist aber wahrscheinlicher auf unspezifische Wechselwirkungen zurückzuführen, da es bis zu 105 verschiedene Antikörper im menschlichen Serum gibt (dh das dritte Problem).Stattdessen verlassen wir uns auf die Wahrscheinlichkeit, um festzustellen, ob die Antwort von bestimmten Interaktionen stammt.Zweitens weisen wir weiter zu:, wobei Dsum eine Variable ähnlich der Rolle von SNR ist und n der Digit-Cutoff-Wert für das digitalisierte diagnostische Microarray ist.Wenn zum Beispiel der Digit-Cutoff n = 2 ist, zeigen Dsum = 0 und 1 gesund an (d. h. negativ für P.-falciparum-spezifische Antikörper) und Dsum ≥ 2 zeigt eine P.-falciparum-Infektion an (d. h. positiv für P.-falciparum-spezifische Antikörper). Antikörper).Eine überraschende Verbesserung wurde beobachtet, als wir den Digit-Cutoff auf n = 2 setzten;Sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität stiegen von unter 73,2 % auf 92,7 % bzw. von 98,4 % auf 99,2 % (Abb. 5a,b).Binarisierungs-/Digitalisierungsstrategie und RDT-Validierung (a) Im Single-Index-Modus mit Intensitäts-Cutoff bei SNR = 2,3 hatte P34-88 eine Sensitivität von 73,2 % und eine Spezifität von 98,4 %.Die eingefügte Abbildung zeigt eine überlagerte Ansicht zweier Kurven (b).Unter Binarisierung/Digitalisierung und Festlegen des Binär-Cutoff (SNR) und des Digit-Cutoff (n) auf jeweils 2 führte das 8-Peptid zu 92,7 % Sensitivität und 99,2 % Spezifität.(c) Korrelation von 28 Zwei-Peptid-Kombinationen für die mit P. falciparum infizierte Trainingsgruppe.Der Exp.Wert war die aus Experimenten erhaltene Zahl.Für Digit-Cutoff n = 1 ist der Cal.Wert war derselbe wie der Exp.Wert: Diese offenen Punkte befinden sich auf der diagonalen Linie.Für n = 2 ist die Cal.Wert (die durchgezogenen roten Punkte, die durch den gefüllten schwarzen Pfeil angezeigt werden) ist das Produkt von zwei beliebigen Exp.Werte (die offenen roten Punkte, die durch die beiden offenen schwarzen Pfeile angezeigt werden).(d) Korrelation von 56 Drei-Peptid-Kombinationen für die Trainingsgruppe.Für n = 3 ist die Cal.Wert (die ausgefüllten violetten Punkte) ist das Produkt aus drei beliebigen Exp.Werte.(e) Für RDT (ein 3 × 3-Array-Layout): Positivkontrolle, Negativkontrolle und 7 andere Peptide wurden als Region I und II angeordnet.(f) Alle zwei der fünf Punkte in Region II, die positive Ergebnisse zeigen, zeigten eine Malariainfektion an;andernfalls war die Indikation für Malaria negativ.Für mit Malaria infiziertes Serum zeigten zwei Punkte in Region I positives Pv an.Infektion.Keine Punkte zeigten eine Infektion mit P. falciparum an.Ein einzelner Punkt kann nicht sicher interpretiert werden und ein Test durch einen Dritten ist erforderlich.Der Mechanismus hinter der Binarisierungs-/Digitalisierungsbehandlung ist wie folgt: Wir verwenden die Binarisierung, um reagierende Punkte als 1 und nicht reagierende Punkte als 0 zu markieren, was die Verwendung von Dsum ermöglicht, um die Anzahl der reagierenden Punkte anzugeben.Dann verwenden wir die Ziffernabschaltung n, um positive Ergebnisse zu bestätigen und falsche positive Ergebnisse durch das gleichzeitige Auftreten mehrerer reagierender Punkte (Dsum ≥ n) zu eliminieren.Wenn wir den Digit-Cutoff auf n = 2 setzen, zeigen zwei beliebige responsive Peptide ein positives Ergebnis an.Die 8 Peptide ergaben somit 28 Kombinationen ().Für jede dieser 28 Kombinationen gibt es zwei Empfindlichkeitswerte: (i) den berechneten Wert und (ii) den experimentellen Wert (Abb. 5c und Erweiterte Daten Abb. 6).Wenn wir davon ausgehen, dass das Ereignis, dass ein Peptid ein Epitop ist, ein unabhängiges Ereignis ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Peptide gleichzeitig Epitope sind, das einfache Produkt der beiden Einzelwahrscheinlichkeiten, dh die berechnete Sensitivität für die Kombination von Pep5 und Pep7 ist der Wert der X-Achse des Punktes, der durch den gefüllten schwarzen Pfeil in Fig. 5c angegeben ist, 0,659 × 0,553 = 0,364.Alternativ können wir die Empfindlichkeit aus den experimentellen Daten erhalten, die der Wert der Y-Achse desselben Punktes ist, 0,380.Die Summe von 28 Kombinationen ergab somit eine Sensitivität von bis zu 98,4 %, während eine Spezifität von nahezu 100 % beibehalten wurde.Das Erhöhen des Zifferngrenzwerts n auf 3 zeigt, wie einfach die Wahrscheinlichkeit einen großen Unterschied machen kann (Abb. 5d).Eine Testgruppe, die 244 Seren von P. falciparum und 1043 Kontrollseren enthielt, wurde der obigen 8-Peptid-Kombination ausgesetzt.Unter Dsum = 2 erreichten wir eine zufriedenstellende Sensitivität und Spezifität von 98,6 % bzw. 98,0 %.Da ein Schnelldiagnosetest für Malaria besser wäre, haben wir die Chemilumineszenz auf 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)-Färbung geändert, wodurch die Notwendigkeit eines Instruments entfällt.Eine weitere kritische Verbesserung ist die Verwendung von chimären Epitopkonstrukten.Für 6 ECPs mit identifizierten Epitopen haben wir 3 chimäre Epitopkonstrukte geschaffen, die eine verbesserte Empfindlichkeit aufweisen (Tabelle 1).Daher wurden nur 5 Peptide auf den Microarray gedruckt, was die Verwendung vereinfacht (Abb. 5e,f).Außerdem erreichten wir mit 94,7 % bzw. 99,1 % eine zufriedenstellende Sensitivität und Spezifität.Die fehlenden 5 % wurden im Frühstadium der Infektion gefunden und konnten mit IgM nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).Es lag über unseren Erwartungen, dass die ECPs von P. falciparum-Ursprung auch bei einer P. vivax-Infektion wirken würden.Obwohl mit P. vivax infiziertes Serum unterschiedliche Empfindlichkeit zeigte (Tabelle 1), ergab die Kombination aus 5 ECPs eine Empfindlichkeit von 91,4 % (unter Dsum = 2).Die BLAST-Ergebnisse zeigten, dass P. falciparum und P. vivax eine gemeinsame Homologie für diese 5 Peptide und für viele der anderen Peptide, die wir durchmusterten, aufwiesen (erweiterte Datentabelle 5).Um eine Infektion mit P. falciparum und P. vivax zu unterscheiden, wendeten wir die DEIFS auf zwei weitere Proteine ​​mit geringer Homologie an, nämlich P. falciparum und P. vivax CSP (erweiterte Datentabelle 1) und erhielten zwei zusätzliche Peptide, P. vivax CSP -9 und P.falciparum CSP-24.Es wurde festgestellt, dass eine Kombination von 7 ECPs eine Gesamtsensitivität von 95,6 %, eine Gesamtspezifität von 99,1 %, eine P. falciparum-Sensitivität von 94,7 % und eine P. vivax-Sensitivität von 96,7 % aufweist.Wie oben gezeigt, löste DEIFS alle vier identifizierten Probleme, die die Anwendung von Epitopen in der Diagnose verhindern.Mit der Zwei-Runden-Screening-Strategie wurden nur 2038 Peptide mit 30/15 Aminosäuren und 978 Peptide mit 15/12 Aminosäuren-Überlappungen synthetisiert, um die Epitop-Kartierung von 38 Kandidatenproteinen abzuschließen, wohingegen die traditionelle Screening-Strategie mindestens 10240 Peptide mit 15/15 Aminosäuren erforderte. 12 aa überlappt.Die Zwei-Runden-Screening-Strategie spart nicht nur Arbeitsaufwand, sondern auch fast 70,5 % der Kosten.Theoretisch könnte eine in silico-prädizierte Methode die Kosten von DEFIS reduzieren, indem die Anzahl der verwendeten Peptide reduziert wird.Bergmann-Leitner berichtete jedoch in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung, dass die Genauigkeit von Vorhersagealgorithmen stark von einem „Trainings“-Prozess abhängt, der Daten von verwandten Proteinen verwendet22.Über einen detaillierten Vergleich zwischen der Silico-Vorhersage und der DEFIS-Methode wird an anderer Stelle berichtet.Die Immundiversität ist die größte Hürde, die die Verwirklichung des lang vorhergesagten diagnostischen Werts von Epitopen verhindert.Die Heatmap (Abb. 2c) ist eine visuelle Darstellung der Immun-/Epitop-Diversität.Diese Epitopdiversität ist auf die Subjektdiversität zurückzuführen: Für die 289 getesteten Seren fanden wir keine zwei Seren, die das gleiche Reaktions-/Epitopmuster aufwiesen, noch fanden wir irgendeine einzelne Epitopreaktion auf alle 289 Serumproben.Pep4 (Tabelle 1) ist das leistungsstärkste ECP mit einer Seroprävalenz von nur 78,2 %, was bedeutet, dass fast einem Viertel der Malaria-infizierten Bevölkerung Antikörper fehlen, die das Epitop in Pep4 erkennen.Dasselbe Antigen kann aufgrund von interindividuellen Variationen des Immunsystems zu unterschiedlichen Epitopen führen.Eine dreistufige Analysestrategie wurde entwickelt und erfolgreich angewendet, um Epitope mit diagnostischem Wert aufzudecken.Darüber hinaus wendeten wir eine Binarisierungs-/Digitalisierungsstrategie an, um den Widerspruch zwischen Sensitivität und Spezifität zu überwinden.Die Binarisierungsstrategie ist nicht nur ein mathematischer Trick, sondern eine neue Perspektive für die diagnostische Interpretation.Die traditionelle Strategie verwendet SNR, um die Konzentrationsunterschiede von Antikörpern/Antigenen zwischen positiven und negativen Proben zu beurteilen.Unsere Binarisierungsstrategie verwendet Dsum, um die verschiedenen Unterschiede in den Antikörpern zwischen Patienten und gesunden Menschen zu beurteilen.Letzteres ist unempfindlicher gegenüber individuellen Schwankungen, was zu einer robusteren Strategie führt.Die Mikroskopie gilt nach wie vor als Goldstandard für die Diagnose aller Plasmodium-Spezies23.Leider sind dafür qualifizierte Fachleute erforderlich, die in den Epidemiegebieten dieser Krankheiten fehlen8,24.Verglichen mit RDT auf der Basis von P. falciparum HRPII ist dieser digitalisierte Microarray mit 7 Peptiden frei von falsch negativen Ergebnissen aufgrund der P. falciparum HRPII-Gendeletion.Im Vergleich zur PCR ist der Peptid-Microarray billiger und könnte aussagekräftiger sein, wenn ein High-Content-Diagnostik-Microarray entwickelt werden könnte, was derzeit in unserem Labor durchgeführt wird.Es ist uns auch gelungen, diese DEIFS-Strategie auf andere Infektionskrankheiten wie Tuberkulose (Bakterium) und Hand-Fuß-Mund-Krankheit (HFMD, Virus) auszudehnen, sofern das Immunsystem auf die Infektion mit der Produktion von Antikörpern reagiert.Obwohl ein groß angelegtes lineares B-Zell-Epitop-Screening die Voraussetzung für eine solche digitalisierte diagnostische Mikroarray-Entwicklung ist und gewisse Kosten erfordert, könnten die Gesamtkosten geteilt werden, da der Mikroarray auch eine Verwendung bei der Entdeckung von Impfstoffkandidaten, der Bewertung finden kann Impfstoffstärke und die Untersuchung des Krankheitsverlaufs.Es gibt immer noch viele Infektionskrankheiten, denen geeignete diagnostische Werkzeuge fehlen, insbesondere vernachlässigte Tropenkrankheiten, weil der Identifizierungsprozess Genomik, Protein-Engineering und viele andere Disziplinen umfasst25 und wirtschaftlich nicht tragbar ist.Die standardisierte DEIFS-Methode kostet nur 100.000 US-Dollar und drei Monate, um ein RDT zu entwickeln, eine Schätzung, die auf dem EV71-Virus (10 Proteine) basiert, das HFMD verursacht.Somit ist DEIFS leicht auf andere Infektionskrankheiten anwendbar, insbesondere auf vernachlässigte Tropenkrankheiten, die in weniger entwickelten Ländern erhebliche wirtschaftliche Belastungen und humanitäre Krisen verursachen, indem ein Chip hergestellt wird, der 1000.000 Peptide enthält und in der Lage ist, 200 Krankheitserreger in einem Test zu untersuchen.Insgesamt wurden 924 mit Malaria infizierte Seren und 1257 gesunde Seren in dieser Studie verwendet. 289 (179 + 110) Proben von mit P. falciparum infiziertem Serum, 176 Proben von mit P. vivax infiziertem Serum wurden aus dem südwestlichen Gebiet von China gesammelt bestätigt durch die Mikroskopmethode;214 (125 + 89) negative Proben von gesundem Serum wurden von örtlichen Krankenhäusern gesammelt.Diese Proben wurden als Trainingsgruppe für das Seroscreening verwendet.244 Proben von mit P. falciparum infiziertem Serum, 215 Proben von mit P. vivax infiziertem Serum, 1043 negative Proben von gesundem Serum wurden vom Institute of Malaria Control in der Provinz Yunnan, China, erhalten, die durch das Mikroskopverfahren bestätigt wurden.Diese Proben wurden als Testgruppe für das Seroscreening verwendet (erweiterte Daten, Tabelle 2).Von allen Probanden wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.Alle mit Malaria infizierten Serumproben wurden nach Beginn gesammelt.Das meiste des mit P. falciparum infizierten Serums wurde im Ringstadium gesammelt, einige wenige im Gametophytenstadium.P.vivax-infizierte Serumproben wurden im Erythrozytenstadium (Merozoiten-, Ring-, Trophozoiten- und Schizontenstadium) gesammelt.Für die Testgruppenstudie wurden randomisierte, doppelblinde, parallel kontrollierte Studien durchgeführt.iPDMS-Membran26 (15 × 15 mm2) wurde von SJ Biomaterials (Suzhou, China) bezogen.1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Medpep (Shanghai, China) gekauft.Peptid (Länge 30 Aminosäuren) wurde von GL Biochem (Shanghai, China) synthetisiert.Menschliches IgG (H-IgG) wurde von DGCS-Bio (Peking, China) erworben.Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG (HRP-IgG) wurde von ZSGB-Bio (Peking, China) bezogen.Peroxidase-Konjugat-Stabilisator/Verdünnungsmittel und Chemilumineszenz-Substrat (SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate) wurden von Thermo Fischer (USA) erworben.Das chromogene Tetramethylbenzidin (TMB)-Reagenz wurde vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China, bezogen.Kommerzielles Malaria-Testprodukt: BinaxNow ® Malaria Test 25 Testkit 27 (Nachbestellnummer #: 660-000) wurden von Alere (Shanghai) Medical Sales Co., Ltd. erworben;Wondfo® One Step Malaia Pf pan Test 100 Testkit28 wurden von Wondfo Biotech Co., Ltd (Guangzhou) gekauft.Microarray wurde in einem 100.000-Grad-Reinraum hergestellt.Die Peptide wurden zuerst mit 30 %iger Acetonitrillösung (v/v, in Milli-Q-Wasser) zu 1 mg mL−1 Stammlösung gelöst und dann in 200 μg mL−1 mit Druckpuffer (0,3 M PB, 0,2 % Glycerin, 0,01 % Triton und 1,5 % Mannit) für den weiteren Druck.iPDMS-Membranen wurden zuerst mit 0,1 M EDC und 0,1 M NHS-Mischungen für 30 min aktiviert und dann mit Milli-Q-Wasser gespült und sofort zum Drucken verwendet.Für die Trainingsgruppe verwendeten wir eine hausgemachte Reaktionskammer, um ein doppelseitiges Screening für wiederholte Experimente durchzuführen (erweiterte Daten, Abb. 2a).Mikroarray wurde unter Verwendung des Kontaktdruckers Smart 48 (Capitalbio, Peking, China) mit etwa 0,6 nL Drucklösung für jede Probe hergestellt.Alle Peptidproben wurden einzeln gedruckt, um ein 7 × 7 × 4-Array zu bilden, jedes Sub-Array hat eine Positivkontrolle mit H-IgG in einer Konzentration von 100 μg ml−1 und eine Negativkontrolle mit Druckpuffer (Erweiterte Daten, Abb. 2b) Für die Testgruppe wurde ein Mikroarray unter Verwendung des berührungslosen Druckers sciFLEXARRAYER S1 (Scienion Co., Berlin, Deutschland) mit 200 Tropfen einer 0,4-nl-Drucklösung für jedes Peptid in dreifacher Ausführung hergestellt.Als Positivkontrolle wurde auch H-IgG in einer Konzentration von 100 μg mL−1 und als Negativkontrolle Druckpuffer getüpfelt.Das Serum wurde zuerst 1:200 mit Serumverdünnungspuffer (1 % Rinderserumalbumin, 1 % Casein, 0,5 % Saccharose, 0,2 % Polyvinylpyrrolidon, 0,5 % Tween20 in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH = 7,4) verdünnt und 200 μl wurden hinzugefügt in jedes Peptid-Microarray geben, 30 min auf dem Schüttler inkubieren (150 U/min, 22 °C).Als Negativkontrolle wurde ein mit Serumverdünnungspuffer inkubierter Microarray durchgeführt.Der Microarray wurde dann 3 Mal mit Waschpuffer gespült und mit 200 μl 1 mg/ml HRP-IgG verdünnt 1:20000 in Peroxidase Conjugate Stabilizer/Diluent für weitere 30 min auf dem Schüttler (150 U/min, 22 °C) inkubiert, gefolgt von denselben Waschschritten wie oben beschrieben.15 &mgr;l Chemilumineszenz-Substrat wurden auf den Mikroarray gegeben und die Bilder wurden bei einer Wellenlänge von 635 nm unter Verwendung des LAS4000-Bildgebungssystems (GE, USA) aufgenommen.Die Datenanalyse wurde gemäß dem Arbeitsablauf von Erweiterte Daten Abb. 2d–h durchgeführt.Für das RDT-Experiment wurden 100 μL Serumprobe in 1 : 10 Verdünnung für 15 min auf dem Schüttler (150 U/min, 22 °C) inkubiert, 3 Mal mit Waschpuffer gespült und mit 100 μL 0,8 mg/mL HRP- 1 : 8000 verdünntes IgG in Peroxidase-Konjugat-Stabilisator/Verdünnungsmittel für 15 min auf dem Schüttler (150 U/min, 22 °C), gefolgt von demselben Waschschritt.100 &mgr;l chromogenes TMB-Reagenz wurden auf den Mikroarray gegeben und 3 min stehen gelassen, um die Ergebnisse abzulesen.Die statistischen Analysen wurden alle mit R Version 3.0.0 (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich, ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org) berechnet.Signifikante Analysen von Mikroarrays (SAM) werden mit dem „samr“-Paket durchgeführt.Clusteranalyse und Heatmap werden mit dem Paket „pheatmap“ durchgeführt.Die Handlung der Violine wird mit dem Paket „beeswarm“ ausgeführt.Receiver Operator Characteristic Curve (ROCC) wird mit dem „OptimalCutpoints“-Paket durchgeführt.Wissenschaft.Weltgesundheitsorganisation.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenJeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt